ད་ལྟོའི་ཁ་བྱང་། ཀོ་ལོན་ ༥༠༩༣༡ ཇར་མ་ནི་ ཀོ་ལོན་ རྒས་ཤོས་དང་འབྲེལ་བའི་ནད་རིགས་ནང་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་གནོན་ཤུགས་ལན་འདེབས་སྐོར་གྱི་ ཁྱད་འཕགས་ཚོགས་པའི་ཞིབ་འཚོལ། (CECAD)
Mitochondrialགི་ནད་གཞི་འདི་ ལོག་མ་ཚུགསཔ་སྦེ་བརྩི་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ རྩ་ཁམས་ནང་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ནུས་པ་འདི་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ mitochondrialགི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་འདི་གིས་ གཟུགས་ཀྱི་ནང་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ནུས་པ་ལུ་ ཕན་གནོད་ག་དེ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན་ན་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ཧ་མ་གོ་བར་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འདི་ནང་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Purkinje neuronsགི་ཁམས་ཕྲན་དམིགས་བསལ་གྱི་proteomeའདི་ mitochondrial fusion dynamicsལས་བརྟེན་ཏེ་ OXPHOSམ་ལངམ་སྦེ་ཡོད་མི་འདི་ ངོ་སྤྲོད་འབདཝ་ཨིན་མས། ང་བཅས་ཀྱིས་ mitochondrialལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་འདི་གིས་ proteomicsགི་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་སྦོམ་སྦེ་རང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་མ་ཤི་བའི་ཧེ་མ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལས་རིམ་ཚུ་ འགོ་བཙུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག རེ་བ་མེད་པར་ ང་བཅས་ཀྱིས་ pyruvate carboxylase (PCx) དང་ གཞན་མི་ peroxidases ཚུ་ TCA འཁོར་རིམ་བར་མའི་ ལྷན་ཐབས་དང་འབྲེལ་བའི་ མངོན་གསལ་ཅན་གྱི་ འབྱུང་ཁུངས་ཚུ་ གཏན་འབེབས་བཟོ་ཡི། PCx བཀག་ཆ་འབད་མི་འདི་གིས་ བཙོག་པ་གི་གནོན་ཤུགས་དང་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་ཚུ་ ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ལས་ འདི་གིས་ OXPHOSམེད་པའི་ རྩ་ཁམས་ཚུ་ལུ་ ཁྲག་རྩ་ཉམས་འགྱོ་མི་འདི་གིས་ ཉེན་སྲུང་འབད་ཚུགས་པའི་ནུས་པ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། མར་ཉམས་འགྱོ་མི་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ mitochondrial fusion ལོག་སྟེ་བཟོ་མི་འདི་གིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་ཆོས་ཚུ་ ཕྱི་འགྱུར་སྦེ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཤི་ནི་ལས་ བཀག་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། ང་བཅས་ཀྱིས་ ཞིབ་འཇུག་འབད་མི་འདི་གིས་ ཧེ་མ་ལས་མ་ཤེས་པའི་ mitochondrial གི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་ལུ་ བཟོད་བསྲན་འབད་ཚུགས་པའི་ ལམ་ལུགས་ཚུ་ངོས་འཛིན་འབད་དེ་ ནད་གཞི་འདི་ མཇུག་བསྡུ་ཁམས་ཅིག་ཁར་ཡང་ རྩ་ཁམས་ཉམས་འགྱོ་མི་འདི་ ཕྱི་འགྱུར་སྦེ་འགྱོ་ཚུགསཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
རྩ་ཁམས་ནུས་ཤུགས་བཞུ་ཁུ་བདག་འཛིན་འཐབ་ནི་གི་དོན་ལུ་ mitochondriaགི་འགན་ཁུར་ལྟེ་བ་འདི་ མི་གི་ནད་གཞི་དང་འབྲེལ་བའི་ རྩ་ཁམས་རིག་པའི་རྟགས་མཚན་ཚུ་གིས་ གཙོ་བོར་བསྟེན་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འ་ནི་ནད་གཞི་མང་ཤོས་ཅིག་རང་ mitochondrialརིགས་མཚན་གྱི་རྣམ་པ་ལུ་ རིགས་མཚན་འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་མི་དང་ ཡང་ན་ mitochondrial dynamicsདང་འབྲེལ་བའི་རིགས་མཚན་མེདཔ་བཏང་མི་ལས་བརྟེན་ཏེ་ འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ mitochondrial DNA(mtDNA)གི་བརྟན་ཏོག་ཏོ་ལུ་ ཐད་ཀར་དུ་ ཐོ་ཕོགཔ་ཨིན་མས། སེམས་ཅན་གྱི་དཔེ་ཚད་ནང་ལུ་ལཱ་འབད་མི་འདི་གིས་ མཐའ་འཁོར་གྱི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ mitochondrialགི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་(༥ལས་༧)འདི་ ལཱ་འབད་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་ལས་ ནད་གཞི་འདི་གི་སྐོར་ལས་ ཁག་ཆེ་བའི་ཤེས་རྟོགས་བྱིན་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། འདི་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ ཀླདཔ་གི་ནང་ལུ་ mitochondrial adenosine triphosphate(ATP)བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མ་ཚུགས་མི་ལས་བརྟེན་ཏེ་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་ནང་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་འགྱུར་བ་བྱུང་མི་འདི་ གཞི་རྩ་ཅིག་ཨིནམ་ལས་ ནད་གཞི་བཀག་ཐབས་ལུ་ སྨན་བཅོས་དམིགས་གཏད་ངོས་འཛིན་འབད་དགོཔ་འདི་ ཁག་ཆེཝ་ཅིག་ཨིན་མས། རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་འགོག་ཐབས་ (9). བརྡ་དོན་མེད་མི་འདི་ རྩ་ཁམས་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ མཐའ་འཁོར་གྱི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་བསྒྱུར་བཅོས་འདི་ གནམ་མེད་ས་མེད་ཉུང་སུ་ཅིག་ཡོདཔ་སྦེ་ བརྩི་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། ཁམས་ཕྲན་འདི་ཚུ་གིས་ ཀླདཔ་གི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་ བཀྲམ་སྤེལ་འབད་ནི་དང་ རྨ་སྐྱོན་དང་ནད་གཞི་ཚུ་ལུ་ ངོས་ལེན་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ མཉམ་འབྲེལ་འབད་ནི་གི་འགན་ཁུར་སྦོམ་སྦེ་རང་འབག་དོ་ཡོདཔ་ལས་ ཀླདཔ་གི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་ མཐུན་སྒྲིག་འབད་ཚུགས་པའི་ ལྕོགས་གྲུབ་འདི་ glialཁམས་ཕྲན་ལུ་རྐྱངམ་ཅིག་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འདི་གི་ཁ་སྐོང་ལུ་ ཀླདཔ་གི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་མ་འདྲཝ་སྦེ་ཡོད་མི་འདི་གིས་ དམིགས་བསལ་གྱི་རྩ་ཁམས་སྡེ་ཚན་ནང་ལུ་ བཅུད་གྱུར་གྱི་འགྱུར་བ་ཚུ་གི་སྐོར་ལས་ ཞིབ་འཇུག་འབད་ནི་ལུ་ ཐོ་ཕོགཔ་ཨིན་མས། འདི་གིས་ རྩ་ཁམས་ནང་ལུ་ mitochondrial ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་མི་ལུ་བརྟེན་ཏེ་ ཁམས་ཕྲན་དང་ བཅུད་གྱུར་གྱི་གནད་དོན་ཚུ་གི་སྐོར་ལས་ དེ་ཅིག་རང་མ་ཤེསཔ་ཨིན་མས།
mitochondrial གི་ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་པའི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནད་དོན་ཚུ་ཧ་གོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Purkinje neurons (PNs) འདི་ mitochondrial གི་ཕྱི་ཁའི་གདོང་ཁེབས་བསྲེ་སྦྱོར་ལས་བརྟེན་ཏེ་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་ཀྱི་གནས་རིམ་མ་འདྲཝ་ཚུ་ནང་ སོ་སོ་སྦེ་བཞག་ནུག མི་ལུ་ Mfn2འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་མི་འདི་ Charcot-Marie-Tooth type 2A(15)ཟེར་མི་ རིགས་བརྒྱུད་ཀྱི་དབང་རྩའི་ནད་གཞི་དང་འབྲེལ་བ་ཡོད་རུང་ བྱི་ཙི་ནང་ལུ་ Mfn2འདི་ མེདཔ་བཏང་མི་འདི་ oxidation Phosphorylation(OXthoPHD)གི་ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་མི་ལུ་བརྟེན་ཏེ་ཨིན་མས། རྩ་ཁམས་དབྱེ་བ་མ་འདྲཝ་ (༡༦-༡༩) དང་ དེ་ལས་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་ཀྱི་ ཕེ་ནོ་ཊའིཔ་འདི་ གཡོ་འགུལ་གྱི་དཀའ་ངལ་ (༡༨, ༡༩) ཡང་ན་ cerebellar ataxia (༡༦) བཟུམ་གྱི་ རྩ་ཁམས་རིག་པའི་རྟགས་མཚན་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། ཁ་ཡིག་མེད་པའི་འབོར་ཚད་(LFQ) proteomicsདང་ metabolomics དེ་ལས་ པར་རིས་དང་ ནད་འབུཔ་རིག་པའི་ཐབས་ལམ་ཚུ་ མཉམ་སྡེབ་འབད་དེ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཡར་འཕེལ་འགྱོ་བའི་རྩ་ཁམས་མར་ཕབ་འགྱོ་མི་འདི་གིས་ pyruvate carboxylase(PCx)དང་ གཞན་མི་རྒྱུ་རྐྱེན་ཚུ་ ཤུགས་སྦེ་རང་ འབྱུང་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ཞིབ་འཇུག་འདི་གི་འབྲེལ་བ་བདེན་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Mfn2-deficient PNsནང་ལུ་ PCxགི་རྣམ་པ་འདི་ མར་ཕབ་འབད་དེ་ འདི་གིས་ oxidative stressདང་ neurodegenerationམགྱོགས་དྲགས་སྦེ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག MFN2གིས་ OXPHOSམ་ལང་མི་དང་ mitochondrial DNAམང་སུ་སྦེ་སྤྱོད་མི་ དེ་ལས་ mitochondrialགི་མཐུན་རྐྱེན་ཚུ་ ཆ་མེད་བཏང་མི་ PNའདི་ རྩ་ཁམས་མར་ཕབ་འགྱོ་མི་འདི་ ནད་གཞི་མ་ཐོན་པའི་ཧེ་མ་ལས་རང་ དྲག་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
Mfn2 knockout PNsནང་ལུ་ mitochondriaའདི་ མཐོང་ཚུགས་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Creལུ་བརྟེན་པའི་ mitochondriaའདི་ དམིགས་གཏད་བསྐྱེད་བཅུག་མི་ བྱི་ཙི་གི་རིགས་ཅིག་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འོད་མདངས་སེརཔོ་གི་ཟས་བཅུད་(YFP)(mtYFP)(20) Creགི་རྣམ་པ་དང་ vivoནང་ལུ་ mitochondrialགི་སྲོག་ལྡན་རིག་པ་འདི་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ནུག ང་བཅས་ཀྱིས་ PNsནང་ལུ་ Mfn2རིགས་མཚན་མེདཔ་བཏང་མི་འདི་གིས་ mitochondrial network(པར་རིས་S1A)འདི་ རིམ་གྱི་སྦེ་ བགོ་བཤའ་རྐྱབ་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ཡོདཔ་ད་ འགྱུར་བ་འགོ་དང་པ་འདི་ བདུན་ཕྲག་༣ལངམ་ད་ལུ་མཐོང་ནུག འདི་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ PNཁམས་ཕྲན་གྱི་བང་རིམ་འདི་ བདུན་ཕྲག་༡༢མ་ལང་ཚུན་ཚོད་ མར་ཕབ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། mitochondrialགི་སྲོག་ཆགས་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་འགོ་དང་པ་འགྱོ་མི་དང་ རྩ་ཁམས་ཤི་མི་གི་བར་ན་ དུས་ཚོད་མ་མཐུནམ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་མ་ཤི་བའི་ཧེ་མ་ mitochondrialགི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་ལས་བརྟེན་ཏེ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་འགྱུར་བ་ཚུ་ ཞིབ་དཔྱད་འབད་དགོཔ་ཐོན་ནུག ང་བཅས་ཀྱིས་ YFP (YFP+)-expressing PN (པར་རིས་ ༡C) དང་ ཚད་འཛིན་བྱི་ཙི་ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ཚུ་ སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ནིའི་དོན་ལུ་ འོད་མདངས་ཅན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་སེལ་ (FACS) ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ ཐབས་ཤེས་ཅིག་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། འདོན་སྤེལ།: ༢༠༡༡/༠༤/༢༠ རིག་པ།(༡) འབྲུག་རྒྱང་བསྒྲགས་ལས་ཁུངས་ཀྱིས་ འབྲུག་རྒྱང་བསྒྲགས་ལས་ཁུངས་ལུ་ བརྡ་དོན་འཕྲུལ་རིག་དང་འབྲེལ་བའི་ ལས་རིམ་ཚུ་ འགོ་འདྲེན་འཐབ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། དབྱེ་ཁག་བཟོ་མི་མི་རློབས་ཀྱི་ངོ་རྟགས་བདེན་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ LFQ proteomics དང་ དེ་ལས་ ཆ་ཤས་གཙོ་བོ་གི་དབྱེ་དཔྱད་འབད་དེ་ YFPhigh དང་ YFPneg ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ དབྱེ་བ་གསལ་ཏོག་ཏོ་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག(པར་རིས་S1C) YFPhighཁམས་ཕྲན་གྱིས་ PNsརྟགས་མཚན་ཚུ་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། རང་དབང་ཅན་གྱི་བརྟག་དཔྱད་ནང་ལུ་བསྡུ་སྒྲིག་འབད་མི་ YFPhigh ཁམས་ཕྲན་གྱི་དཔེ་ཚད་ཚུ་གི་བར་ན་ ག་བསྡུར་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ འབྲེལ་བའི་འཇོན་ཐངས་> ༠.༩ སྟོན་ཡོདཔ་ལས་ སྐྱེ་ལྡན་རིག་པའི་འདྲ་དཔེ་ཚུ་གི་བར་ན་ སྐྱེ་འཕེལ་ལེགས་ཤོམ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། བཅུད་བསྡུས་ནང་ གནས་སྡུད་འདི་ཚུ་གིས་ ང་བཅས་རའི་འཆར་གཞི་འདི་ འབད་ཚུགས་པའི་ PN གི་ ཚབས་ཆེན་དང་ དམིགས་བསལ་གྱི་ སོ་སོ་སྦེ་བཞག་ནི་གི་འཆར་གཞི་འདི་ བདེན་དཔྱད་འབད་ཡི། འདོན་སྤེལ།: ༢༠༡༠/༠༣/༠༣ རིག་པ།(༢༣) ང་བཅས་ཀྱིས་ CTRL དང་གནས་སྟངས་ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ལས་ བྱི་ཙི་ཚུ་ བསད་ནི་འགོ་བཙུགས་ཡི། ལོག་སྟེ་བསྡོམས་ཚར་བའི་ཤུལ་ལས་ བདུན་ཕྲག་༤ ལངམ་ད་ལུ་ Mfn2cKO ཟེར་སླབ་ཨིན། མཐའ་མཇུག་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ PN བང་རིམ་འདི་ མཐོང་གསལ་ཅན་གྱི་ mitochondrial ཆ་ཤས་ཚུ་ཡོད་རུང་ ད་ལྟོ་ཡང་ མ་བཤིག་པར་ཡོད་པའི་སྐབས་ བདུན་ཕྲག་༨ གི་ལོ་ཚད་འདི་ གདམ་ཁ་རྐྱབ་ཅི། བསྡོམས་ཀྱིས་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཟས་བཅུད་༣༠༡༣ བསྡོམས་རྩིས་འབད་ཡོདཔ་ད་ དེ་གི་ནང་ལས་ བརྒྱ་ཆ་༢༢དེ་ཅིག་ MitoCarta ༢.༠ གི་མཆན་འགྲེལ་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ mitochondrial proteome ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ཨིན་མས། བདུན་ཕྲག་༨པའི་ནང་ རིགས་མཚན་གྱི་ཁྱད་པར་དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ ཇུ་རྩི་བརྒྱ་ཆ་༡༠དང་ཚག་༥ལུ་རྐྱངམ་ཅིག་ འགྱུར་བ་སྦོམ་སྦེ་རང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། གནས་སྡུད་ཆ་ཚན་འདི་གི་ “གསར་བཏོད་ཀྱི་ལམ་ལུགས་དབྱེ་དཔྱད” འདི་གིས་ རིགས་མཚན་མ་འདྲཝ་སྦེ་བཏོན་མི་འདི་ ངོ་མ་རང་ དམིགས་བསལ་གྱི་བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་ཆ་ཚན་ནང་ལུ་ཚུདཔ་ཨིནམ་སྦེ་སྟོན་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། མ་གཞི་ OXPHOSདང་ calciumདང་འབྲེལ་བའི་ལམ་ལུགས་ཚུ་ མར་ཕབ་འགྱོ་མི་འདི་གིས་ PNsནང་ལུ་ mitochondrialལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་འདི་ ངེས་གཏན་བཟོཝ་ཨིན་རུང་ གཞན་མི་དབྱེ་ཁག་ནང་ལུ་ amino acidགི་བཅུད་འགྱུར་འདི་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་རང་ འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། Rewiring འདི་ རྟག་བརྟན་ཨིན། ལས་འགན་མེད་པ།
(ཀ) CTRL དང་ Mfn2cKO བྱི་ཙི་གི་ cerebellar ཆ་ཤས་ཀྱི་ ངོ་ཚབ་ཀྱི་ confocal པར་རིས་ཚུ་གིས་ PNs གི་ཡར་རྒྱས་འགྱོ་བའི་གྱོང་རྒུད་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། (calbindin, gray); nuclei འདི་ DAPI དང་ཅིག་ཁར་ གདོང་ལན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (ཁ) (ཀ) གི་འབོར་ཚད་ (ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད། ***P<0.001; n = 4 to 6 circles བྱི་ཙི་གསུམ་ལས་) (C) བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ལཱ་འབད་ཐངས། (D) Purkinje (མགོ) དང་གཞན་ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་བ་ (དབུས་) ལུ་དམིགས་བསལ་གྱི་རྟགས་བཀོད་མི་ཚུ་གི་དྲོད་སབ་ཁྲ་བཀྲམ་སྤེལ་འབད་ནི། (E) དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་པའི་ PN ནང་ལུ་ mitochondrial ཟས་བཅུད་ཀྱི་གྱངས་ཁ་སྟོན་མི་ Venn རི་མོ། (F) བདུན་ཕྲག་༨གི་རིང་ལུ་ Mfn2cKOགི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ ཟས་བཅུད་མ་འདྲཝ་སྦེ་བཏོན་མི་གི་མེ་རུད་ཀྱི་ས་ཁྲ། (G) གསར་གཏོད་ཀྱི་ལམ་ལུགས་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ བདུན་ཕྲག་༨ ལུ་དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་མི་ Mfn2cKO PN ནང་ ཡར་འཕར་གྱི་ལམ་ལུགས་ (དམརཔོ) དང་ མར་གྱི་ལམ་ལུགས་ (ཧོནམ) གི་ལམ་ལུགས་ཁག་ཆེ་ཤོས་ལྔ་སྟོནམ་ཨིན། བརྟག་དཔྱད་འབད་མི་ ཟས་བཅུད་རེ་རེ་གི་ སྤྱིར་སྙོམས་བརྡ་སྟོན་གནས་ཚད་འདི་ སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། གེ་རེ་སི་ཀེལ་དྲོད་ཚད་སབ་ཁྲ་: བདེ་སྒྲིག་འབད་ཡོད་པའི་པི་གནས་གོང་། ns, གལ་ཆེ་མིན།
Proteomicsགི་གནས་སྡུད་ནང་ལུ་ ཟས་བཅུད་ཀྱི་བརྡ་སྟོན་འདི་ རིམ་གྱི་སྦེ་ མར་ཕབ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། Complexes I, III, དང་ IV ཆ་མཉམ་ལུ་ mtDNA-encoded subunits ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ complex II འདི་ nuclear-coded རྐྱངམ་ཅིག་ཨིནམ་ལས་ གཞི་རྟེན་ལུ་ གནོད་པ་མེདཔ་ཨིན། (པར་རིས་༢A དང་པར་རིས་S2A) . ཟས་བཅུད་ཀྱི་གྲུབ་འབྲས་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ ཀླདཔ་གི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ MTCO1(mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) གི་གནས་རིམ་འདི་ PNནང་ལུ་ རིམ་གྱི་སྦེ་ མར་ཕབ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། mtDNA-encoded subunit Mtatp8འདི་ མར་ཕབ་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ nuclear-encoded ATP synthase subunitགི་གནས་ཚད་འདི་ འགྱུར་བ་མེད་པར་ལུས་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ mtDNAགི་རྣམ་པ་བརྟན་ཏོག་ཏོ་སྦེ་ཡོད་པའི་སྐབས་ལུ་ ATP synthase subassembly F1དང་ཅིག་ཁར་ ཆ་མཚུངས་ཨིན་མས། གྲུབ་ཚུལ་འདི་ རིམ་མཐུན་ཨིན། བར་ཆད་ (༧)། mtDNA གི་གནས་ཚད་འདི་ དུས་ཚོད་ངོ་མའི་ polymerase chain reaction (qPCR) གིས་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་མི་ Mfn2cKO PNs ནང་ལུ་ mtDNA གི་གནས་ཚད་འདི་ རིམ་གྱིས་སྦེ་ མར་ཕབ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ ངེས་གཏན་བཟོ་ནུག ཚད་འཛིན་སྡེ་ཚན་དང་ག་བསྡུར་འབད་བ་ཅིན་ བདུན་ཕྲག་༨ ལུ་ mtDNA གི་གནས་ཚད་བརྒྱ་ཆ་༢༠ དེ་ཅིག་རྐྱངམ་ཅིག་ བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་༢C) འ་ནི་གྲུབ་འབྲས་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ DNAབརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ Mfn2cKO PNsགི་ confocal microscopy stainingགིས་ mitochondrial nucleotidesགི་དུས་ཚོད་ལུ་བརྟེན་པའི་ ཟད་འགྲོ་བཏང་མི་འདི་སྟོནམ་ཨིན་མས།(པར་རིས་༢D) Lonp1དང་Afg3l2དེ་ལས་ Clpx དེ་ལས་ OXPHOSཚུ་རྩིས་ཏེ་ mitochondrialཟས་བཅུད་མར་ཕབ་དང་ གནོན་ཤུགས་ལུ་ལན་ལོག་འབད་མི་ འདེམས་ངོ་ལ་ལུ་ཅིག་རྐྱངམ་ཅིག་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག apoptosis ནང་འབྲེལ་གཏོགས་ཡོད་པའི་ཟས་བཅུད་ཀྱི་གནས་ཚད་ནང་ འགྱུར་བ་གལ་ཅན་ཅིག་ མཐོང་མ་ཚུགས།(པར་རིས་ S2B) དེ་བཟུམ་སྦེ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ དཀར་རྫས་སྐྱེལ་འདྲེན་ནང་ འབྲེལ་གཏོགས་ཡོད་མི་ mitochondria དང་ endoplasmic reticulum གི་རྒྱུན་ལམ་ཚུ་ལུ་ འགྱུར་བ་ཆུང་ཀུ་ཅིག་ལས་བརྒལ་མེདཔ་སྦེ་ མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ S2C) འདི་གི་ཁ་སྐོང་ལུ་ autophagyདང་འབྲེལ་བའི་ཟས་བཅུད་ཀྱི་དབྱེ་ཞིབ་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ འགྱུར་བ་སྦོམ་ཅིག་མ་ཐོནམ་ལས་ འདི་ཡང་ immunohistochemistryདང་ electron microscopyགིས་ བལྟ་བརྟོག་འབད་མི་ autophagosomesགི་མཐོང་སྣང་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ཨིན་མས། ཨིན་རུང་ PNsནང་ལུ་ OXPHOSགི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་འདི་ mitochondrialགི་འགྱུར་བ་དང་གཅིག་ཁར་ འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། བདུན་ཕྲག་༥ དང་༨ ལང་མི་ Mfn2cKO PNs གི་ཁམས་ཕྲན་དང་ dendritic trees ནང་ལུ་ Mitochondrial clusters མཐོང་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ད་ ནང་ན་གི་བཟོ་བཀོད་འདི་ འགྱུར་བ་སྦོམ་སྦེ་རང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་བཟུམ་གྱི་འགྱུར་བ་དང་ mtDNA མར་ཕབ་འགྱོ་མི་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) དང་ཅིག་ཁར་ ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ Mfn2cKO PNs ནང་ལུ་ mitochondrial membrane གི་འོས་འབབ་འདི་ མར་ཕབ་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
(ཀ) OXPHOS མགུ་རྙོག་ཅན་གྱི་བརྡ་སྟོན་གནས་རིམ་གྱི་དུས་ཚོད་སློབ་ཚན་དབྱེ་དཔྱད། བདུན་ཕྲག་༨ ལུ་ P<0.05 ཡོད་པའི་ཟས་བཅུད་ཚུ་རྐྱངམ་ཅིག་ བརྩི་འཇོག་འབད་དགོ། (two-way ANOVA) ཚག་ཅན་གྱི་གྲལ་ཐིག་: སི་ཊི་ཨར་ཨེལ་དང་ཕྱདཔ་ད་ བདེ་སྒྲིག་མེད། (ཁ) གཡོན་ཕྱོགས་: ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ཅིག་གི་དཔེ་ཅིག་ anti-MTCO1 ནུས་གཟུགས་དང་གཅིག་ཁར་ རྟགས་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། (scale bar, 20 μm) Purkinje ཁམས་ཕྲན་གཟུགས་ཚུ་གིས་ བཟུང་ཡོད་པའི་ས་ཁོངས་འདི་ སེརཔོ་གིས་ བཀབ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། གཡས་ཕྱོགས་: MTCO1 གནས་ཚད་ཀྱི་ཚད་གཞི་ (ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་གི་དབྱེ་དཔྱད། n = 7 ལས་ 20 ཁམས་ཕྲན་བྱི་ཙི་གསུམ་ལས་དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ།) (C) དབྱེ་སེལ་འབད་ཡོད་པའི་ PN ནང་ mtDNA འདྲ་བཤུས་ཨང་གྲངས་ཀྱི་ qPCR དབྱེ་དཔྱད། (ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད། n = 3 to 7 mice) (D) གཡོན་ཕྱོགས། དཔེར་ན་ cerebellar slice གིས་ anti-DNA ནུས་གཟུགས་བཀོད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། (scale bar, 20 μm) Purkinje ཁམས་ཕྲན་གཟུགས་ཚུ་གིས་ བཟུང་ཡོད་པའི་ས་ཁོངས་འདི་ སེརཔོ་གིས་ བཀབ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། གཡས་ཕྱོགས་ལུ་ mtDNA གི་རྨ་སྐྱོན་ཚུ་གི་འབོར་ཚད་ ༼ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད། n = བྱི་ཙི་གསུམ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་༥ལས་༩ཚུན་༽ (E) ཁམས་ཕྲན་ཆ་མཉམ་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་ཐོ་བཀོད་ནང་ mitoYFP + Purkinje ཁམས་ཕྲན་ (མདའ་རྟགས་) སྟོན་མི་ acute cerebellar section གི་དཔེ་ཅིག། (F) IV གུག་རྟགས་ཀྱི་ཚད་གཞི། (G) CTRL དང་ Mfn2cKO Purkinje ཁམས་ཕྲན་ནང་ ད་ལྟོའི་སྨན་ཁབ་བཙུགས་པའི་ ངོ་ཚབ་ཐོ་བཀོད། མཐོ་ཤོས་རྗེས་འདེད་: ཨེ་པི་འདི་ འབྱུང་བཅུག་མི་ པཱལསི་འགོ་དང་པ། འོག་གི་རྗེས་འདེད།: ཨེ་པི་བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་ཤོས། (H) རང་བཞིན་གྱི་འབྱུང་ཁུངས་ (sPSPs) གི་ཚད་གཞི། ངོ་ཚབ་སྒྲ་བཟུང་རྗེས་ཤུལ་དང་ དེ་གི་རྒྱས་ཟུམ་ཆ་ཚད་འདི་ (I) ནང་ལུ་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱིས་ བྱི་ཙི་གསུམ་ལས་ n = ༥ ལས་ ༢༠ ཚུན་ ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། གནད་སྡུད་ཚུ་ སྤྱིར་སྙོམས་±SEM སྦེ་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། *P<༠.༠༥; **P<༠.༠༡; ***P<༠.༠༠༡. (J) དོང་ཅན་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་བཀག་ཆ་ཐབས་ལམ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ རང་བཞིན་གྱི་ཨེ་པི་གི་ངོ་ཚབ་རྗེས་ཤུལ་ཚུ་ཐོ་བཀོད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། མཐོ་ཤོས་རྗེས་འདེད།: ཨེ་པི་བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་ཤོས། འོག་གི་རྗེས་ཤུལ་: ཨེ་པི་རྐྱང་པའི་ཆེར་ཟུམ། (K) (J) དང་འཁྲིལ་ཏེ་ སྤྱིར་སྙོམས་དང་མཐོ་ཤོས་ AP བསྐྱར་འབྱུང་ཚད་གཞི་བཟོ། མཱན་ཝིཊ་ནི་བརྟག་དཔྱད་; n = 5 ཁམས་ཕྲན་བྱི་ལི་བཞི་ལས་དབྱེ་ཞིབ་བྱས། གནད་སྡུད་ཚུ་ སྤྱིར་སྙོམས་±SEM སྦེ་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། ཁག་ཆེཝ་མེན།
བདུན་ཕྲག་༨ ལང་མི་ Mfn2cKO PN ནང་ལུ་ OXPHOS གི་གནོད་སྐྱོན་འདི་ གསལ་ཏོག་ཏོ་སྦེ་མཐོང་ཡོདཔ་ལས་ འདི་གིས་ རྩ་ཁམས་ཚུ་གི་གཟུགས་ཁམས་རིག་པའི་ལས་འགན་འདི་ གནམ་མེད་ས་མེད་ སྤྱིར་བཏང་མེན་པའི་རྟགས་མཚན་སྟོནམ་ཨིན། དེ་འབདཝ་ལས་ ང་བཅས་ཀྱིས་ བདུན་ཕྲག་༤ ལས་༥ དང་ བདུན་ཕྲག་༧ ལས་༨ གི་བར་ན་ OXPHOS-deficient neurons གི་ གློག་ཤུགས་ཀྱི་ ཁྱད་ཆོས་ཚུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་དེ་ acute cerebellar slices ནང་ ཁམས་ཕྲན་ཆ་མཉམ་གྱི་ ཐིག་ཁྲམ་གྱི་ ཐོ་བཀོད་ཚུ་ འབད་དེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡི། ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ ཁྱད་པར་ཆུང་ཀུ་ཅིག་ཡོད་རུང་ རེ་བ་མེད་པར་ སྤྱིར་སྙོམས་ལུ་ ངལ་གསོ་འབད་ནི་གི་ འོས་འབབ་དང་ Mfn2cKO གི་རྩ་ཕྲན་གྱི་ བཀག་ཆ་ཚུ་ ཚད་འཛིན་དང་ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་བཟུམ་སྦེ་ བདུན་ཕྲག་༤ ལས་༥ གི་བར་ན་ ད་ལྟོའི་གློག་ཤུགས་ཀྱི་ འབྲེལ་བ་ (IV curve) ལུ་ འགྱུར་བ་སྦོམ་ཅིག་ མ་མཐོང་པས། ཨིན་རུང་ བདུན་ཕྲག་༧ལས་༨གི་བར་ན་འབད་མི་ Mfn2cKOགི་རྩ་ཕྲན་ཚུ་ IVགི་ཐབས་ལམ་ནང་ལས་ མཐར་འཁྱོལ་མ་ཚུགསཔ་ལས་ འདི་གིས་ མཇུག་བསྡུ་ཁམས་ཅིག་ཁར་ hyperpolarizationགི་འོས་འབབ་ལུ་ ཚོར་སྣང་གསལ་ཏོག་ཏོ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན་མས། འདི་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ Mfn2cKOགི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ བསྐྱར་ལོག་འབད་བའི་ནུས་པ་ཐོན་མི་ depolarizing currentsའདི་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་རང་ བཟོད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ལས་ སྤྱིར་བཏང་བཏོན་མི་འདི་ བདུན་ཕྲག་༨གི་ཚད་འཛིན་རྩ་ཕྲན་ལས་ ཁྱད་པར་ག་ནི་ཡང་མེདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།(ཐིག་ཁྲམ་༡དང་པར་རིས་༢G) དེ་བཟུམ་སྦེ་ རང་བཞིན་གྱི་ postsynaptic currents (sPSCs) གི་བསྐྱར་འབྱུང་དང་ འཕར་ཚད་འདི་ ཚད་འཛིན་སྡེ་ཚན་གྱི་བསྐྱར་འབྱུང་དང་ ག་བསྡུར་འབད་ཚུགསཔ་ཨིནམ་མ་ཚད་ བྱུང་རིམ་གྱི་བསྐྱར་འབྱུང་འདི་ བདུན་ཕྲག་༤ ལས་ བདུན་ཕྲག་༥ ལས་ བདུན་ཕྲག་༧ ལས་༨ ལུ་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ ཡར་སེང་འགྱོ་ཡོདཔ་ཨིན། PNs ནང་ synaptic རྒས་ཚད་ཀྱི་དུས་ཡུན། (25) དེ་དང་འདྲ་བའི་གྲུབ་འབྲས་འདི་ PNs patches བཏོན་པའི་ཤུལ་ལས་ཐོབ་ཡོདཔ་ཨིན། རིམ་སྒྲིག་འདི་གིས་ ཁམས་ཕྲན་ཨེ་ཊི་པི་སྐྱོན་ཚུ་གི་ འོས་འབབ་ཅན་གྱི་རྒུད་འཐུས་ཚུ་ བཀག་ཆ་འབདཝ་ཨིན་ དེ་ཡང་ ཁམས་ཕྲན་ཆ་མཉམ་གྱི་ ཐིག་ཁྲམ་བཀག་ཆ་ཐོ་བཀོད་ནང་ འབྱུང་སྲིད་ནི་ཨིན་མས། དམིགས་བསལ་གྱིས་ ངལ་གསོ་འབད་བའི་ གདོང་ཁེབས་ཀྱི་འོས་འབབ་དང་ Mfn2cKO གི་རྩ་ཕྲན་གྱི་ རང་བཞིན་གྱི་ བསྐྱར་འབྱུང་ལུ་ གནོད་སྐྱོན་མ་བྱུང་པས། (པར་རིས་ ༢ དང་ J དང་ K) བཅུད་བསྡུས་ནང་ལུ་ གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ OXPHOS གི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་ PNs ཚུ་གིས་ བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་དྲགས་ཀྱི་ བཏོན་གཏང་ཐངས་ཚུ་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ གདོང་ལེན་འབད་ཚུགསཔ་སྦེ་ བརྡ་སྟོནམ་ཨིན་མས།
གནས་སྡུད་ཚུ་ སྤྱིར་སྙོམས་ ± SEM (ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད་ Holm-Sidak གི་སྣ་མང་ག་བསྡུར་བརྟག་དཔྱད། *P<0.05) སྦེ་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། ཆ་ཚན་ཨང་འདི་གུག་ཤད་ཚུ་གིས་བརྡ་སྟོནམ་ཨིན།
ང་བཅས་ཀྱིས་ proteomics གི་གནས་སྡུད་ཆ་ཚན་ནང་ལུ་ དབྱེ་ཁག་ག་ཅི་བཟུམ་ཅིག་འབད་རུང་ OXPHOS མ་ལང་པའི་དཀའ་ངལ་འདི་ བཀག་ཐབས་འབད་ཚུགས་པའི་ ལམ་ལུགས་ཚུ་ཡོདཔ་ཨིན་ན་མེན་ན་ ཞིབ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ འགོ་བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། . Proteomicsགི་དབྱེ་དཔྱད་ནང་ལུ་ amino acids(BCAA)གི་ནང་ལུ་ བཞུ་ཁུ་འདི་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་རང་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག(པར་རིས་༣Aདང་པར་རིས་S5A) ང་ཚོས་ BCAA transaminase 1 (BCAT1) དང་ BCAT2 གཉིས་ཀའི་ནང་དོན་ཡར་སེང་བྱུང་བ་མཐོང་། ཁོང་གིས་ α-ketoglutarate(26)ལས་ glutamateབཏོན་ཞིནམ་ལས་ BCAAགི་རྫས་སྦྱོར་གྱི་གོ་རིམ་འགོ་དང་པ་འདི་ འགྱུར་བཅོས་འབད་ནུག ཡན་ལག་ཅན་གྱི་ keto acid dehydrogenase(BCKD)གི་མགུ་རྙོག་དྲགས་འདི་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། ཨིན་རུང་ BCAAནང་ལུ་ འགྱུར་བ་ག་ནི་ཡང་མ་མཐོང་པས། OXPHOSམེད་མི་ PNsགིས་ བདུན་ཕྲག་༨ལངམ་ད་ལུ་ glutamineགི་བཤིག་ནི་དང་ བརྗེ་སོར་གྱི་ལཱ་ཚུ་ ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ mitochondrial enzymes glutaminase(GLS)དང་ glutamine pyruvate transaminase(GPT2)གི་ཚད་གཞི་ཡར་སེང་འགྱོ་མི་ལས་བརྟེན་ཏེ་ཨིན་མས། GLSགི་ཚད་གཞི་འདི་ spliced ​​isoform glutaminase C(GLS-GAC)ལུ་རྐྱངམ་ཅིག་ཡོདཔ་ལས་ (Mfn2cKO/CTRLགི་འགྱུར་བ་འདི་ ཧ་ལམ་ ༤.༥-fold, P = ༠.༠༥) དེ་ལས་ ཀེན་སར་གྱི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ དམིགས་བསལ་གྱི་ཚད་གཞི་འདི་གིས་ mitochnergyondrialལུ་རྒྱབ་སྐྱོར་འབད་ཚུགས། (༢༧)།
(ཀ) དྲོད་ཚད་ཀྱི་སབ་ཁྲ་འདི་གིས་ བདུན་ཕྲག་༨ ལུ་ གསལ་བཀོད་འབད་ཡོད་པའི་ལམ་ལུགས་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཟས་བཅུད་གནས་ཚད་ཀྱི་ བསྒྱུར་བཅོས་བསྒྱུར་བཅོས་སྟོནམ་ཨིན། (ཁ) དཔེར་ན་ cerebellar slice གིས་ anti-PCx ནུས་གཟུགས་ (scale bar, 20 μm) བཀོད་ཡོད་པའི་རྟགས་བཀོད་ཡོད། མདའ་རྟགས་སེརཔོ་འདི་གིས་ པུར་ཀིན་ཇེ་ཁམས་ཕྲན་གཟུགས་ལུ་སྟོནམ་ཨིན། (C) དུས་ཚོད་ཀྱི་ཟས་བཅུད་བརྡ་སྟོན་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ ཁྲག་རྩའི་ནད་གཞི་གི་དོན་ལུ་ ཁག་ཆེ་བའི་འདེམས་ངོ་ཅིག་སྦེ་ངོས་འཛིན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 mice). (D) གོང་ལུ་: [1-13C]pyruvate tracer ནང་ལུ་ཡོད་པའི་ རྟགས་བཀོད་ཡོད་པའི་ནག་རྫས་ནང་འཛུལ་ཐབས་ལམ་སོ་སོ་སྟོན་མི་ རིམ་སྒྲིག་རི་མོ། (དེ་ཡང་ PDH ཡང་ན་ trans-arterial route བརྒྱུད་དེ་) གཤམ་ལུ་: བཱའི་ཨོ་ལིན་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་འདི་གིས་ བརྒྱ་ཆ་གཅིག་ལུ་ རྟགས་བཀོད་ཡོད་པའི་ ནག་རྫས་ (M1) འདི་ aspartic acid, citric acid དང་ malic acid ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01) གིས་ acute cerebellar slices ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (ང) བརྡ་སྟོན་པའི་ལམ་གྱི་དུས་ཚོད་ལོ་རྒྱུས་ཡོངས་སུ་རྫོགས་པའི་དབྱེ་ཞིབ། བདུན་ཕྲག་༨ལུ་ P<0.05ཡོད་པའི་ཟས་བཅུད་ཚུ་རྐྱངམ་ཅིག་བརྩི་འཇོག་འབད་དགོ། ཐིག་ཕྲེང་: བདེ་སྒྲིག་གནས་གོང་མེད་ (འགྱུར་ལྡོག་གི་ཕྱོགས་གཉིས་ཀྱི་དབྱེ་དཔྱད་; * P <0.05; *** P <0.001). གནད་སྡུད་ཚུ་ སྤྱིར་སྙོམས་±SEM སྦེ་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན།
ང་བཅས་ཀྱིས་དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ BCAA catabolismའདི་ ལམ་ལུགས་གཙོ་བོ་ཅིག་ལུ་འགྱུར་ནུག འདི་གིས་ ཤུགས་སྦེ་རང་ བསམ་འཆར་བཀོད་མི་ནང་ TCA འཁོར་རིམ་ནང་འཛུལ་མི་ རླུང་འཚུབ་ཀྱི་ཚད་གཞི་འདི་ OXPHOS མེད་པའི་ PN ནང་ལུ་ འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་འོང་ཟེར་ཨིན་མས། འདི་གིས་ རྩ་ཁམས་ནང་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ལཱ་འབད་མི་ཅིག་ཨིནམ་ད་ འདི་གིས་ OXPHOSལཱ་འབད་མ་ཚུགས་པའི་སྐབས་ལུ་ རྩ་ཁམས་ཀྱི་གཟུགས་ཁམས་རིག་པ་དང་ མི་ཚེ་གནས་ཐབས་ལུ་ ཐད་ཀར་དུ་ ཕན་གནོད་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འ་ནི་རིག་ཚོད་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཁྲག་རྩ་མར་ཕབ་ཀྱི་བཞུ་ཁུ་ PCxའདི་ ཡར་འཕར་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག(Mfn2cKO/CTRLའདི་ ཧ་ལམ་ཚར་༡.༥དེ་ཅིག་འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། ༣༠)། proteomicsགི་གྲུབ་འབྲས་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ confocal microscopyགིས་ PCxགི་རྣམ་པ་འདི་ OXPHOS-deficient PNsནང་ལུ་ དམིགས་བསལ་གྱིས་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག PCx གི་བལྟ་རྟོགས་ཡར་འཕར་གྱི་ལཱ་འགན་བརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ [1-13C]pyruvate tracer གི་ཐོག་ལས་ cerebellar གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ སྨན་བཅོས་འབད་ཡི། pyruvateའདི་ pyruvate dehydrogenase(PDH)གིས་ བཙོག་རླུང་བཟོ་བའི་སྐབས་ལུ་ isotopeགི་མིང་བྱང་འདི་ མེདཔ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ pyruvateའདི་ ཁྲག་རྒྱུན་གྱི་ཐོག་ལས་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ TCAགི་འཁོར་རིམ་ནང་ལུ་ གྲལ་གཏོགས་འབདཝ་ཨིན་མས།(པར་རིས་༣D) ང་བཅས་རའི་ proteomicsགི་གནས་སྡུད་ལུ་རྒྱབ་སྐྱོར་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Mfn2cKOགི་ aspartic acidནང་ལུ་ རྟགས་མཚན་ལེ་ཤ་ཅིག་རང་ མཐོང་ཡོདཔ་ད་ citric acidདང་ malic acidལུ་ཡང་ བར་མཚམས་ཅན་གྱི་གནས་སྟངས་ཅིག་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ གལ་གནད་ཅན་ཅིག་མེན་པས།
MitoParkགི་བྱི་ཙི་གི་ནང་ལུ་ mitochondrialགི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་འདི་ dopamine neuronsགིས་ mitochondrial transcription factor Aརིགས་མཚན་འདི་ མེདཔ་བཏང་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། གཟུགས་པོའི་ནང་ OXPHOS ཡོད། འདི་ཡང་ བཞུ་ཁུ་འདི་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ཐོན་མི་ གཞན་དང་མ་འདྲ་བའི་ enzymes(32-34)འདི་ OXPHOSམེད་མི་ PNsནང་ལུ་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་རང་ ཚད་འཛིན་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། enzyme 3 (ME3), དེའི་འགན་ཁུར་གཙོ་བོ་ནི་ malate ལས་ pyruvate ལོག་ཐོབ་རྒྱུ་དེ་རེད། (པར་རིས་ ༣, A དང་ C) (33, 35) དེ་མ་ཚད་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Pdk3 བཞུ་ཁུ་ནང་ ཕོསི་ཕོ་རི་ལེཊ་འབད་དེ་ PDH (36) ལུ་ ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་བཟོ་མི་ Pdp1 བཞུ་ཁུ་ནང་ འགྱུར་བ་ག་ནི་ཡང་ མ་མཐོང་པས། དུས་རྒྱུན་དུ་ Mern2cKO PNs ནང་ལུ་ Ser293 ནང་ལུ་ PDH མགུ་རྙོག་དྲགས་ཀྱི་ pyruvate dehydrogenase E1 ཆ་ཤས་ཀྱི་ α1 subunit α (PDHE1α) subunit གི་ phosphorylation འདི་ ཡར་དྲག་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། Pyruvateལུ་ ཁྲག་རྒྱུན་མེདཔ་ཨིན་མས།
མཐའ་མཇུག་ཁར་ ང་བཅས་ཀྱིས་ serine དང་ glycine གི་སྐྱེ་ལྡན་སྦྱོར་སྡེབ་ཀྱི་ལམ་ལུགས་དང་ འབྲེལ་ཡོད་ mitochondrial folate (1C) འཁོར་རིམ་ དེ་ལས་ proline biosynthesis (པར་རིས་ 1G དང་ པར་རིས་ S5C) ཚུ་ ཤུགས་བཏོན་པའི་སྐབས་ལུ་ གལ་གནད་ཅན་ཅིག་སྦེ་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་སྦེ་ སྙན་ཞུ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ཨིན་མས། མཐའ་འཁོར་གྱི་རྩ་ཕྲན་ཚུ་ mitochondrial dysfunction (5-7) དང་ཅིག་ཁར་ ལཱ་འབད་བཅུགཔ་ཨིན། འ་ནི་ཟས་བཅུད་ཀྱི་གནས་སྡུད་ལུ་རྒྱབ་སྐྱོར་འབད་མི་ དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་སྐབས་ལུ་ OXPHOSམེད་པའི་ PNནང་ལུ་ བདུན་ཕྲག་༨ལང་མི་ བྱི་ཙི་གི་ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ mitochondrial folateའཁོར་རིམ་གྱི་ བཞུ་ཁུ་གཙོ་བོ་ཅིག་ཨིན་མི་ serine hydroxymethyltransferase 2(SHMT2)ལུ་བཙུགས་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། གལ་གནད་ཅན་གྱི་ནད་འགོག་ལན་འདེབས་ (པར་རིས་ S5D)། CU-glucose-incubated acute cerebellar slices ༡༣ནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་བརྟག་དཔྱད་འདི་གིས་ serineདང་prolineགི་སྐྱེ་ལྡན་སྦྱོར་རྫས་འདི་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། GLSདང་GPT2གིས་ glutamineལས་ glutamateམཉམ་སྦྱོར་འབད་ནི་དང་ glutamateདང་α-ketoglutarateགི་བར་ན་ལུ་ བརྡ་སྤྲོད་འབད་ནི་གི་འགན་ཁུར་འབགཔ་ལས་ OXPHOSམ་ལང་པའི་རྩ་ཕྲན་ཚུ་ལུ་ glutamateགི་དགོས་མཁོ་ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། འགྱུར་བ་འདི་ཚུ་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ PN-specific Mfn2cKOབྱི་ཙི་ལས་ cerebellar astrocytesགི་ proteomicདབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ འ་ནི་ལམ་ལུགས་འདི་ (antiperoxidasesཆ་མཉམ་རྩིས་ཏེ་) བརྡ་སྟོན་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་སྦོམ་ཅིག་མ་བྱུངམ་ལས་ འདི་གིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་འདི་ DNལས་ ​​G6ལུ་ མར་ཕབ་འགྱོ་ནི་ལུ་ གདམ་ཁ་ཅན་ཅིག་ཨིནམ་སྦེ་སྟོན་ནུག
བཅུད་བསྡུས་ནང་ལུ་ འ་ནི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ PNsནང་ལུ་ དམིགས་བསལ་གྱི་བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་ཚུ་ དུས་ཚོད་ཀྱི་ཐོག་ལས་ ཤུགས་བཏོན་ནི་གི་རྣམ་པ་མ་འདྲཝ་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ནུག མ་གཞི་ སྤྱིར་བཏང་མེན་པའི་ རྩ་ཁམས་ཀྱི་ལཱ་འགན་འདི་གིས་ ཧེ་མ་ལས་རང་ atherosclerosisདང་ 1C remodeling(པར་རིས་3Eདང་S5C) དེ་ལས་ Iདང་IVགི་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ serine de novoམཉམ་སྦྱོར་གྱི་འགྱུར་བ་འདི་ མཇུག་བསྡུ་ཁམས་ཅིག་ཁར་རྐྱངམ་ཅིག་ མཐོང་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། OXPHOS ལས་འགན་མ་འགྲུབ་པ་ (པར་རིས་ ༣E དང་པར་རིས་ S5C)། འ་ནི་སྙན་ཞུ་འདི་གིས་ mitochondrial(1Cའཁོར་རིམ་)དང་ cytoplasmic(serine biosynthesis)གིས་ TCAའཁོར་རིམ་ནང་ལུ་ ཁྲག་རྩ་གི་ནད་གཞི་ཡར་སེང་འགྱོ་མི་ལུ་ ལན་གསལ་འབད་མི་གི་བྱ་རིམ་ཅིག་ཨིན་མས།
བདུན་ཕྲག་༨ལང་མི་ OXPHOS-deficient PNsགིས་ བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་བའི་ སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་བཅུག་ནི་དང་ mitochondrial dysfunctionལུ་ ཁ་གསབ་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ལཱ་ཚུ་ གལ་ཅན་སྦེ་འབད་ཚུགས། འ་ནི་གསར་ཐོབ་འདི་གིས་ ད་རེས་ནངས་པའི་གནས་སྟངས་ནང་ལུ་ཡང་ འ་ནི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་འགྱོ་ནི་འདི་ ཕྱི་སུ་ཅིག་སྦེ་འགྱོ་ནི་དང་ ཡང་ན་ བཀག་ཐབས་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ སྨན་བཅོས་ཀྱི་བར་འཛུལ་འབད་ནི་གི་འོས་འབབ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། འཕྱིས་སུ་ཅིག། ང་བཅས་ཀྱིས་ རང་དབང་ཅན་གྱི་བར་འཛུལ་གཉིས་ཀྱི་ཐོག་ལས་ འོས་འབབ་འདི་སེལ་ཡི། ཐབས་ལམ་དང་པའི་ནང་ ང་བཅས་ཀྱིས་ Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector བཟོ་བཀོད་འབད་ཡོདཔ་ལས་ MFN2 འདི་ OXPHOS-deficient PNs in vivo ནང་ལུ་ དམ་ཁ་རྐྱབ་ཚུགསཔ་སྦེ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། AAV encoding MFN2 དང་ fluorescent reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) འདི་ vitro གི་ནང་ལུ་ རྩ་ཁམས་ལམ་སྲོལ་ནང་ལུ་ བདེན་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ MFN2 འདི་ Cre ལུ་བརྟེན་པའི་ཐོག་ལས་ བཏོན་ཚུགས་ཏེ་ mitochondrial གི་སྲོག་ལྡན་རིག་པ་འདི་ ཉམས་སྲུང་འབད་དེ་ Mfns DKO, B Figure S7 ནང་ལུ་ རྩ་ཁམས་འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་ནི་ལས་ བཀག་ཚུགས་ནུག དེ་ལས་ ང་བཅས་ཀྱིས་ བདུན་ཕྲག་༨ ལང་མི་ Mfn2-AAV འདི་ Mfn2cKO དང་ ཚད་འཛིན་བྱི་ཙི་གི་ cerebellar cortex ལུ་ stereotactically བཏང་ནི་གི་དོན་ལས་ vivo ནང་ལུ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་དེ་ བདུན་ཕྲག་༡༢ ལང་མི་ བྱི་ཙི་ཚུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡི། (པར་རིས་༤ཀ) སྨན་བཅོས་བྱས་པའི་Mfn2cKO བྱི་ལི་ཤི་སོང་།(པར་རིས་ ༡ ཀ་དང་ཁ) (༡༦) ཕྲ་རབས་ནད་འབུཔ་གི་འགྱུར་བ་འདི་གིས་ ཀླདཔ་གི་སྒོར་ཐིག་ལ་ལུ་ཅིག་ནང་ལུ་ PNགི་གདམ་ཁ་ཅན་གྱི་བརྡ་སྟོན་ཐོན་ནུག(པར་རིས་S7དང་G དེ་ལས་ H) mCherry (Ctrl-AAV) རྐྱངམ་ཅིག་བཏོན་མི་ ཚད་འཛིན་ AAV གི་སྨན་ཁབ་བཙུགས་མི་འདི་གིས་ Mfn2cKO སེམས་ཅན་ཚུ་ལུ་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་ཀྱི་གནས་ཚད་ལུ་ གལ་གནད་ཅན་གྱི་གནོད་པ་མེདཔ་ཨིན། དེ་དང་ཕྱདཔ་ད་ Mfn2-AAV དང་ཅིག་ཁར་ བརྗེ་སོར་འབད་མི་ Mfn2cKOs དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ PN ཁམས་ཕྲན་བང་རིམ་གྱི་ ཉེན་སྲུང་གི་ནུས་པ་ གལ་ཅན་ཅིག་ མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ ༤ དང་ ཁ་ དེ་ལས་ ག) དམིགས་བསལ་གྱིས་ རྩ་ཁམས་ཀྱི་སྟུག་ཚད་འདི་ ཚད་འཛིན་སེམས་ཅན་ཚུ་ལས་ ཧ་ལམ་དབྱེ་བ་ཕྱེ་མ་ཚུགསཔ་སྦེ་མཐོངམ་ཨིན། MFN1གི་བརྡ་སྟོན་འདི་ MFN2མེན་རུང་ རྩ་ཁམས་ཤི་རྐྱེན་ལས་ ཉེན་སྲུང་འབད་ནི་ལུ་ ཕན་ནུས་ཅན་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། PNགི་གནས་ཚད་ནང་ལུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ Mfn2-AAVགིས་ mitochondriaགི་ ultrastructureདང་ mtDNAགི་གནས་ཚད་ཚུ་ སྤྱིར་བཏང་སྦེ་བཟོ་སྟེ་ anti-angiogenesis marker PCxགི་བརྡ་སྟོན་མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག ངལ་གསོའི་གནས་སྟངས་ནང་ ཉེན་སྐྱོབ་འབད་མི་ Mfn2cKO བྱི་ཙི་ཚུ་ མཐོང་སྣང་གིས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ ཁོང་གི་ གཟུགས་ཀྱི་དབྱིབས་དང་ འགུལ་སྐྱོད་ཀྱི་རྟགས་མཚན་ (S1 ལས་ S3 ཚུན་) ཡར་དྲག་འགྱོ་ཡོདཔ་སྦེ་ མཐོང་ནུག། མཇུག་ལུ་ འ་ནི་བརྟག་དཔྱད་འདི་གིས་ OXPHOSནང་ལུ་ MFN2འདི་ PNsནང་ལུ་ལོག་སྟེ་བཙུགས་ནི་འདི་ ཕྱི་སོངཔ་ལས་ mtDNAཟ་སྤྱོད་འབད་ནི་དང་ ཁྲག་རྩ་གི་ནད་གཞི་ཐོན་ནི་འདི་ ལངམ་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
(ཀ) བརྡ་སྟོན་འབད་ཡོད་པའི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་འདི་ ཤུགས་ལྡན་བཟོ་བའི་སྐབས་ AAV encoding MFN2 བཙུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ལས་རིམ་སྟོན་མི་ འཆར་གཞི་ཅིག། (ཁ) བདུན་ཕྲག་༨ ལུ་ Mfn2cKO བྱི་ཙི་དང་གཅིག་ཁར་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དེ་ བདུན་ཕྲག་༡༢ ལང་མི་ cerebellar གི་ཆ་ཤས་ཚུ་གི་ ངོ་ཚབ་ཀྱི་ ཀོན་ཕོ་ཀཱལ་པར་ཚུ་ ངོས་འཛིན་འབད་དེ་ ཀལ་བྷིན་ཌིན་ནུས་གཟུགས་ཀྱི་ རྟགས་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། གཡས་ཕྱོགས་: axon fibers གི་ཚད་འཇལ་ནི། axon zoom གི་ཚད་གཞི་འདི་ ༤༥༠ དང་ ༧༥ μm ཨིན། (C) གཡོན་ཕྱོགས། AAV བརྗེ་སོར་གྱི་བསྐྱར་འཁོར་ནང་ Purkinje ཁམས་ཕྲན་གྱི་མཐུག་ཚད་ཀྱི་ཚད་གཞི་ (AAV+) (ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད། n = 3 mice) གཡས་ཕྱོགས་: བདུན་ཕྲག་༡༢པའི་ནང་ mtDNA གཙོ་བོར་བཏོན་མི་ PN ནང་ལུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། * P <༠.༠༥; ** P <༠.༠༡. (D) བརྡ་སྟོན་ཡོད་པའི་ ནད་འབུབ་ཀྱི་ནད་འབུཔ་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ བརྡ་སྟོན་འབད་མི་ Mfn2cKO cerebellar sections གི་ PNs གི་ ངོ་ཚབ་བརྡ་སྤྲོད་གློག་རྫས་ཕྲ་གཟུགས་པར་རིས་ཚུ། གདོང་ཁེབས་ཚོས་གཞི་དམརཔོ་འདི་གིས་ ཌེནཌ་རའིཊ་ཚུ་གིས་ བཀང་ཡོད་པའི་ས་ཁོངས་འདི་ གསལ་བཏོན་འབདཝ་ཨིནམ་དང་ གཡས་ཁ་ཐུག་ལུ་བྱིན་ཡོད་པའི་ རྒྱ་བསྐྱེད་འབད་མི་འདི་ ཚག་སེརཔོ་གི་གྲུ་བཞི་འདི་གིས་ གསལ་བཏོན་འབདཝ་ཨིན། n གིས་ རྡུལ་ཕྲན་སྟོནམ་ཨིན། ཚད་འཇལ་གྱི་ཕྲ་རིང་།, 1μm. (E) བདུན་ཕྲག་ ༡༢ ནང་ PN ནང་ PCx staining གི་དཔེ་སྟོནམ་ཨིན། ཚད་འཇལ་ཕྲ་རིང་ 20μm. OE, མངོན་གསལ་ཆེ་བ།; FC, བཀབ་བསྒྱུར་བསྒྱུར།
མཐའ་མཇུག་ཁར་ ང་བཅས་ཀྱིས་ OXPHOS གི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་པའི་ཉམས་མྱོང་ཐོབ་མི་ PNs ནང་ལུ་ peroxidase-induced cell survival གི་ཁག་ཆེ་ཧིང་འདི་ ཞིབ་དཔྱད་འབད་ཡི། ང་བཅས་ཀྱིས་ mCherry encoding AAV-shRNA (short hairpin RNA) འདི་ དམིགས་བསལ་གྱིས་ བྱི་ཙི་PCx mRNA ༼AAV-shPCx༽ ལུ་དམིགས་གཏད་བསྐྱེད་དེ་ ཕྲ་རབས་ནད་འབུཔ་ཡང་ན་ འདི་གི་ཚད་འཛིན་༼AAV-scr༽ འདི་ Mfn2cKO བྱི་ཙི་གི་ཀླདཔ་ནང་ལུ་བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། བདུན་ཕྲག་བཞི་པའི་ནང་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཡོདཔ་ད་ དེ་ཡང་ PCx གི་བརྡ་སྟོན་ཡར་སེང་འགྱོ་བའི་དུས་ཚོད་ནང་ PCx གིས་ ཕན་ནུས་ཅན་སྦེ་ བཏོན་ཚུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ ༼པར་རིས་ ༣ ཀ༽ དེ་ལས་ PN ཁམས་ཕྲན་བང་རིམ་འདི་ ད་ལྟོ་ཡང་ མ་བཤིག་པར་ཡོདཔ་ཨིན། PCx (པར་རིས་ S8A) མར་ཕབ་འབད་མི་འདི་གིས་ PN ཤི་རྐྱེན་གྱི་ མགྱོགས་ཚད་སྦོམ་སྦེ་རང་ འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ ནད་འབུབ་ཀྱི་ བཀག་ཆ་འབད་ཡོད་པའི་ མཐའ་འཁོར་རྐྱངམ་ཅིག་ཨིན། (པར་རིས་ ༥, B དང་ C) PCx གིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནོད་པ་ཚུ་ ག་དེ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན་ན་ ཧ་གོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ PCx མར་ཕབ་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ PNs གི་གནས་རིམ་འདི་ ཞིབ་འཇུག་འབད་ཡོདཔ་ད་ AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 འདི་ དུས་མཉམ་དུ་ བཤད་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་ལས་ ང་བཅས་ཀྱིས་ བདུན་ཕྲག་༧ལང་མི་ Mfn2cKOགི་ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ནང་ལུ་ འོད་མདངས་གཉིས་ཀྱི་འོད་འཕྲོ་ཅན་གྱི་ཚེ་སྲོག་པར་རིས་ཕྲ་མཐོང་ཆེ་ཤེལ་(FLIM)དང་ ཡང་ན་ FLIMགི་གནས་སྟངས་བདེན་དཔྱད་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ cytoplasmic redoxགནས་ཚད་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་འབྱུང་སྲིད་པའི་འོས་འབབ་ཚུ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ littermatesཚད་འཛིན་འབད་ཡི། དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ PCx བརྡ་སྟོན་མེད་པའི་ Mfn2cKO PNs གཅིག་གི་ བཙའ་ཐངས་གནས་སྟངས་ནང་ ཡར་སེང་སྦོམ་སྦེ་རང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ ཚད་འཛིན་གྱི་རྩ་ཕྲན་དང་ ཡང་ན་ Mfn2cKO PNs གིས་ shRNA བརྡ་སྟོན་འབད་མི་ལས་ སོ་སོ་སྦེ་ཨིན་མས། PCxགི་བརྡ་སྟོན་འདི་ མར་ཕབ་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ Mfn2cKO PNsགི་བརྒྱ་ཆ་འདི་ ཚར་གསུམ་ལྷགཔ་ཅིག་ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
(ཀ) བརྡ་སྟོན་ཡོད་པའི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་འདི་ ཤུགས་ལྡན་བཟོ་བའི་སྐབས་ AAV encoding shPCx བཙུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ལས་རིམ་སྟོན་མི་ འཆར་གཞི་ཅིག། (ཁ) བདུན་ཕྲག་༤ གི་ནང་ལུ་ Mfn2cKO བྱི་ཙི་གི་ནང་ལུ་ བདུན་ཕྲག་༨ ལང་མི་ cerebellar གི་ཆ་ཤས་ཚུ་གི་ ངོ་ཚབ་ཀྱི་ པར་ཚུ་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དེ་ བདུན་ཕྲག་༤ ལུ་ anti-calcineurin ནུས་གཟུགས་ཀྱི་རྟགས་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། ཚད་འཇལ་ཕྲ་རིང་ ༤༥༠μm. (C) AAV-transduced loops ནང་ལུ་ Purkinje ཁམས་ཕྲན་གྱི་མཐུག་ཚད་ཀྱི་ཚད་གཞི་ (ཁྱད་པར་གྱི་ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད། n = 3 to 4 mice) གནད་སྡུད་ཚུ་ སྤྱིར་སྙོམས་±SEM སྦེ་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། ***P<༠.༠༠༡. (D) ངོ་ཚབ་FLIM པར་རིས་ཀྱིས་ བདུན་ཕྲག་ ༧ ལང་མི་ PN གི་ སྤྱིར་སྙོམས་ཚེ་སྲོག་གི་དུས་ཡུན་འདི་ གསལ་བཀོད་འབད་ཡོད་པའི་ བརྟག་དཔྱད་གནས་སྟངས་འོག་ལུ་ glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 བརྡ་སྟོན་འབདཝ་ཨིན། LUT (look-up table) ཆ་ཚད་: མི་ཚེ་གནས་ཐབས་དུས་ཚོད་བར་མཚམས་ (པི་ཀོ་སྐར་ཆ་ནང་)། ཚད་འཇལ་ཕྲ་རིང་ 25μm. (E) histogram གིས་ Grx1-roGFP2 མི་ཚེ་གནས་གོང་ཚུ་ (D) ལས་ བཀྲམ་སྤེལ་སྟོནམ་ཨིན། (n=158 ལས་ 368 ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ གནས་སྟངས་རེ་རེའི་འོག་ལུ་ བྱི་ཙི་གཉིས་ནང་) ཧིསི་ཊོ་གཱརམ་རེ་རེ་གི་ལྟག་ལུ་ཡོད་པའི་ པའི་ཐིག་ཁྲམ་འདི་གིས་ CTRL-AAV-scr ནང་ལུ་ སྤྱིར་སྙོམས་ཚེ་སྲོག་གི་གནས་གོང་ལས་ ༡ SD ལས་ལྷག་སྟེ་ཡོད་མི་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་གྱངས་ཁ་འདི་ མངོན་གསལ་ཅན་སྦེ་ རིངམ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། (F) གྲོས་འཆར་བཀོད་པའི་དཔེ་ཚད་འདི་གིས་ རྩ་ཁམས་PCx གི་སྲུང་སྐྱོབ་ཀྱི་ནུས་པ་སྟོནམ་ཨིན།
འདི་ཡང་ གནས་སྡུད་ཚུ་གིས་ MFN2 གི་བསྐྱར་བརྗོད་འདི་གིས་ OXPHOS མ་ལང་པའི་ PN དང་ mtDNA མར་ཕབ་འགྱོ་མི་ དེ་ལས་ ista བཟུམ་གྱི་ རིགས་མཚན་མ་འདྲཝ་ཚུ་ ཡོངས་སུ་རྫོགསཔ་སྦེ་ སྐྱོབ་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། Neurodegeneration གིས་ ཁམས་ཕྲན་མ་ཤི་བའི་ཧེ་མའི་གནས་རིམ་གྱི་ ལོག་ཚུགས་པའི་སྒྲུབ་བྱེད་བྱིནམ་ཨིན། བཅུད་འགྱུར་གྱི་བསྒྱུར་བཅོས་འདི་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་གྱིས་ ཁྲག་ཤུགས་མར་ཕབ་འབད་ཚུགས་མི་འདི་གིས་ གཙོ་བོར་བསྟེན་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས།
ཞིབ་འཇུག་འདི་ནང་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ PNsགིས་ OXPHOSགི་ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་མི་ལུ་ ལན་གསལ་འབད་མི་འདི་ རིམ་གྱི་སྦེ་ TCAའཁོར་རིམ་གྱི་ཁྲག་རྩའི་ནད་གཞི་ལུ་ འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་མི་གི་ལམ་ལུགས་བརྒྱུད་དེ་ འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ང་བཅས་ཀྱིས་ ཐབས་ལམ་ལེ་ཤ་ཅིག་གི་ཐོག་ལས་ ཟས་བཅུད་ཀྱི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ ངེས་གཏན་བཟོ་ཡོདཔ་མ་ཚད་ mitochondrial གི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་མི་འདི་གིས་ གདོང་ལེན་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ལུ་ ཧེ་མ་ལས་མ་ཤེས་པའི་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ནུས་པ་ཡོདཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ནུག ང་བཅས་ར་ཧ་ལས་དགོཔ་འདི་ གློག་ཐག་བསྐྱར་བཟོ་གི་བྱ་རིམ་འདི་གིས་ རིམ་གྱི་སྦེ་ རྩ་ཁམས་ཉམས་འགྱོ་མི་དང་ཅིག་ཁར་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་གནས་སྟངས་འདི་ ངེས་པར་དུ་མི་བཏུབ་རུང་ གནས་སྡུད་ཚུ་གིས་ ཁམས་ཕྲན་མ་ཤི་བའི་ཧེ་མ་ལས་རང་ རྩ་ཁམས་ཉམས་བཅོས་འབད་ནི་གི་ཐབས་ལམ་ཅིག་ཨིནམ་སྦེ་བཀོད་ནུག ཞིབ་འཇུག་འདི་གིས་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ལུ་ གཟུགས་ཀྱི་ནང་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ནུས་པ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན་མས། འདི་གིས་ ཤུལ་ལས་ MFN2 ལོག་སྟེ་འགོ་བཙུགས་མི་འདི་གིས་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་རྟགས་མཚན་ཚུ་ ཕྱི་འགྱུར་སྦེ་བཟོ་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་མ་ཚད་ PNགི་ཉམས་རྒུད་འདི་ཡང་ བཀག་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། དེ་ལས་ལྡོག་སྟེ་ ཁྲག་རྩའི་ནད་གཞི་འགོག་ཐབས་དང་ རྩ་ཁམས་མགྱོགས་དྲགས་བཟོཝ་ཨིན། transsexual.
ང་བཅས་ཀྱི་ཞིབ་འཚོལ་ནང་ལུ་ སེམས་ཁར་འབབ་སི་སི་ཅིག་འདི་ OXPHOSམེད་མི་ PNsགིས་ TCAའཁོར་རིམ་གྱི་བཅུད་འགྱུར་འདི་ དམིགས་བསལ་གྱིས་ ཁྲག་རྩ་གི་ནད་གཞི་ཐོན་བཅུག་མི་ enzymesཚུ་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ བཟོ་བཅོས་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། བཅུད་འགྱུར་གྱི་གོ་རིམ་འདི་ ཀེན་སར་གྱི་ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ སྤྱིར་བཏང་གི་ཁྱད་རྣམ་ཅིག་ཨིནམ་ད་ ལ་ལུ་ཅིག་གིས་ glutamineལུ་བརྟེན་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ TCAའཁོར་རིམ་གྱི་བར་ན་ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་གྱི་རིམ་སྒྲིག་དང་ མར་ཁུ་དང་nucleotideགི་སྐྱེ་ལྡན་སྦྱོར་རྫས་ཚུ་ བདག་འཛིན་འཐབ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འཕྲལ་གྱི་ཞིབ་འཇུག་ཅིག་གིས་ OXPHOS གི་ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་པའི་ མཐའ་འཁོར་གྱི་རྩ་ཕྲན་ཚུ་ནང་ glutamine/glutamate metabolism གི་མཐུད་འབྲེལ་འདི་ཡང་ ཁྱད་རྣམ་གཙོ་བོ་ཅིག་ཨིནམ་སྦེ་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། ). ཨིན་རུང་ གཟུགས་ཀྱི་ནང་ལུ་ རྩ་ཁམས་བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ གཤེར་ཁུ་དང་ ནད་གཞི་གི་སྐབས་དོན་ནང་ལུ་ འབྲེལ་བ་ཡོད་པའི་སྐོར་ལས་ སྒྲུབ་བྱེད་གསལ་ཏོག་ཏོ་ཅིག་མེདཔ་ཨིན་མས། འཕྲལ་ཁམས་ཅིག་གི་ཞིབ་འཇུག་ནང་ལུ་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ རྩ་ཁམས་བརྒྱུད་སྤེལ་གྱི་དོན་ལུ་ glutamateགི་ཆུ་རྫིང་ཚུ་ བསྡུ་སྒྲིག་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ལས་ འདི་གིས་ བཅུད་གྱུར་གྱི་གནས་སྟངས་ནང་ལུ་ བཙོག་རླུང་དང་ ཁྲག་རྒྱུན་གྱི་ནད་གཞི་ཚུ་ ཡར་དྲག་བཏང་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། སྨན་རིགས་ཀྱི་ཐོག་ལས་ TCAའཁོར་རིམ་གྱི་བཞུ་ཁུ་ succinate dehydrogenaseགིས་ pyruvate carboxylationགིས་ oxaloacetateགི་མཉམ་སྦྱོར་འདི་ བདག་འཛིན་འཐབ་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ཨིན་རུང་ འ་ནི་ཐབས་ལམ་འདི་གི་ ཀླདཔ་གི་རྩ་ཕྲན་ལུ་ གཟུགས་ཁམས་རིག་པའི་འབྲེལ་བ་འདི་ ད་ལྟོ་ཡང་ གཟུགས་ཁམས་རིག་པའི་ཁག་ཆེ་ཤོས་ཅིག་ཨིན་མས། འདི་ཡང་ ང་བཅས་རའི་གནས་སྡུད་ཚུ་གིས་ གཟུགས་ནང་ལུ་ OXPHOS གིས་ གནོད་སྐྱོན་བཏང་མི་ PNs ཚུ་ BCAA གི་མར་ཕབ་དང་ pyruvate carboxylation ལུ་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་ཚུགས་ཟེར་ཨིན་མས། BCAAགིས་ རྩ་ཁམས་ནུས་ཤུགས་བསྒྱུར་བཅོས་ལུ་ ཕན་ཐོགས་ཡོདཔ་སྦེ་ གྲོས་འཆར་བཀོད་དེ་ཡོད་རུང་ glutamateདང་GABAགི་འགན་ཁུར་གྱི་ཁ་སྐོང་ལུ་ རྩ་ཁམས་བརྒྱུད་སྤེལ་གྱི་དོན་ལུ་ ཐབས་ལམ་འདི་གི་སྐོར་ལས་ ད་ལྟོ་ཡང་ སྒྲུབ་བྱེད་མེདཔ་ཨིན་མས། དེ་འབདཝ་ལས་ ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་པའི་ PNs ཚུ་གིས་ རང་བཞིན་གྱིས་ TCA བར་མཚམས་ཀྱི་ ཟ་སྤྱོད་ལུ་ རྒུད་འཐུས་སྤྲོད་ཚུགས་ཟེར་ ཚོད་དཔག་འབད་ནི་ལུ་ འཇམ་ཏོང་ཏོ་ཡོདཔ་ཨིན། དམིགས་བསལ་གྱིས་ PCxགི་ཚད་འཛིན་འདི་ aspartic acidགི་དགོས་མཁོ་ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ mitochondrial dysfunctionཡོད་མི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ཨིན་རུང་ ང་བཅས་ཀྱིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་དབྱེ་དཔྱད་ནང་ལུ་ Mfn2cKO PNs(པར་རིས་S6A)ནང་ལུ་ aspartic acidགི་གནས་ཚད་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་སྦོམ་ཅིག་མ་ཐོནམ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་འཕེལ་འགྱུར་དང་ post-mitotic neuronsགི་བར་ན་ aspartic acidལག་ལེན་འཐབ་མི་གི་ཁྱད་པར་ཚུ་ གསལ་སྟོན་འབདཝ་ཨིན་མས། PCxགིས་ ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་པའི་ རྩ་ཁམས་ནང་ལུ་ ཐབས་ལམ་ངོ་མ་འདི་ ངོས་འཛིན་འབད་མ་ཚུགས་རུང་ ང་བཅས་ཀྱིས་ འདི་གིས་ རྩ་ཁམས་ཚུ་གི་ redoxགནས་སྟངས་བདག་འཛིན་འཐབ་ནི་ལུ་ ཁག་ཆེ་བའི་འགན་ཁུར་འབགཔ་ཨིནམ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ནུག དམིགས་བསལ་གྱིས་ PNsའདི་ PCxལུ་ ཚད་འཛིན་འབད་ནི་ལས་ བཀག་ཐབས་འབད་མི་འདི་གིས་ ཁམས་ཕྲན་ཤི་ནི་འདི་ མགྱོགས་དྲགས་སྦེ་འགྱོ་བཅུགཔ་ཨིན་མས། BCAAམར་ཕབ་དང་ pyruvateགི་carboxylationའདི་ mitochondrialགི་ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་པའི་ མཐའ་འཁོར་གྱི་རྩ་ཕྲན་ཚུ་ ངོས་འཛིན་འབད་ནི་གི་ཐབས་ལམ་ཅིག་མེན། དེ་འབདཝ་ལས་ དེ་ཚུ་ OXPHOS-deficient neurons གི་གཙོ་རིམ་ཅན་གྱི་ཁྱད་རྣམ་ཅིག་སྦེ་མཐོངམ་ཨིན་རུང་ ཁྱད་རྣམ་འདི་རྐྱངམ་ཅིག་མེན་རུང་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཁག་ཆེ་ཤོས་ཅིག་ཨིན་མས། .
Cerebellar ནད་གཞི་འདི་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་ཀྱི་ནད་གཞི་ཅིག་ཨིནམ་ད་ འདི་གིས་ མང་ཤོས་ཅིག་རང་ ataxia ཟེར་སླབ་སྟེ་ PNs ལུ་ གནོད་སྐྱོན་རྐྱབ་ཨིན། འ་ནི་རྩ་ཁམས་ཕྲན་འདི་ དམིགས་བསལ་གྱིས་ mitochondrial dysfunctionལུ་ ཉེན་ཁ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ བྱི་ཙི་ནང་ལུ་ གདམ་ཁ་ཅན་གྱི་མར་ཕབ་འདི་གིས་ མི་གི་spinocerebellar ataxia(16, 47, 48)གི་རྟགས་མཚན་ཚུ་ བཏོན་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། སྙན་ཞུ་དང་འཁྲིལཔ་ད་ རིགས་མཚན་འགྱུར་བཅོས་འབད་མི་བྱི་ཙི་གི་དཔེ་ཚད་འདི་ མི་གི་ spinocerebellar ataxia དང་ mitochondrial dysfunction ༼༤༩, ༥༠༽ དང་ PNPH ནང་ལུ་ OXPHOS མ་ལང་པའི་གནད་ཁུངས་ཚུ་ ཞིབ་འཇུག་འབད་དགོཔ་ཁག་ཆེཝ་སྦེ་བཀོད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་འབདཝ་ལས་ འ་ནི་ཁྱད་པར་ཅན་གྱི་རྩ་ཁམས་མི་རློབས་འདི་ ཕན་ནུས་ཅན་སྦེ་ སོ་སོ་སྦེ་བཞག་སྟེ་ ཞིབ་འཇུག་འབད་ནི་ལུ་ དམིགས་བསལ་གྱིས་ འོས་འབབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཨིན་རུང་ PNsའདི་ གནོན་ཤུགས་ལུ་ གནམ་མེད་ས་མེད་ ཚོར་ཤུགས་ཅན་སྦེ་ཡོདཔ་ལས་ cerebellarཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་ཆ་མཉམ་གྱི་ནང་ལུ་ ཉུང་སུ་ཅིག་ལས་བརྒལ་མེདཔ་ལས་ ཞིབ་འཇུག་མང་ཤོས་ཅིག་ནང་རང་ ཁམས་ཕྲན་ཆ་མཉམ་སྦེ་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་འདི་ ད་ལྟོ་ཡང་ གདོང་ལེན་ཅན་ཅིག་ཨིན་མས། གཞན་མི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ལུ་ བཙོག་པ་མ་འཐོན་ནི་འདི་ ཧ་ལམ་ཅིག་རང་ འབད་མ་ཚུགས་རུང་ (དམིགས་བསལ་གྱིས་ རྒས་ཤོས་ཀྱི་རྩ་ཕྲན) ང་བཅས་ཀྱིས་ FACSདང་གཅིག་ཁར་ ཕན་ནུས་ཅན་གྱི་ཁ་ཕྱེ་ནི་གི་ཐབས་ལམ་འདི་ མཉམ་སྡེབ་འབད་དེ་ ཕྲ་འབུཔ་གི་དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ རྩ་ཕྲན་ལངམ་སྦེ་ཐོབ་ཚུགས་ནུག (༥༡)། ཁམས་ཕྲན་ཆ་མཉམ་གྱི་གནས་སྟངས་ཉམས་སྲུང་འབད་དེ་ ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ mitochondriaནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་ན་མེན་པར་ cytoplasmicགི་ཆ་རོགས་ནང་ལུ་ཡང་ འགྱུར་བ་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། (༥༢, ༥༣)། ང་བཅས་ཀྱིས་འགྲེལ་བཤད་རྐྱབ་མི་ཐབས་ལམ་འདི་ Purkinjeཁམས་ཕྲན་གྱི་ཞིབ་འཇུག་དང་འབྲེལ་བ་རྐྱངམ་ཅིག་མེན་པར་ གཞན་མི་ mitochondrial dysfunctionགི་དཔེ་ཚད་ཚུ་རྩིས་ཏེ་ ནད་གཞི་ཡོད་པའི་ཀླདཔ་ནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་འགྱུར་བ་ཚུ་ བསལ་ནི་གི་དོན་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ག་ཅི་བཟུམ་ཅིག་ལུ་ཡང་ འཇམ་ཏོང་ཏོ་སྦེ་ལག་ལེན་འཐབ་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས།
མཐའ་མཇུག་ཁར་ ང་བཅས་ཀྱིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་བྱ་རིམ་ནང་ལུ་ སྨན་བཅོས་ཀྱི་སྒོ་སྒྲིག་ཅིག་ངོས་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་གནོན་ཤུགས་ཀྱི་རྟགས་མཚན་ཚུ་ ཡོངས་རྫོགས་སྦེ་ ཕྱི་འགྱུར་སྦེ་བཟོ་ཚུགས་ནི་ཨིནམ་མ་ཚད་ རྩ་ཁམས་ཉམས་རྒུད་འགྱོ་ནི་ལས་ བཀག་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས། འདི་འབདཝ་ལས་ ནཱ་ལུ་གསལ་བཀོད་འབད་དེ་ཡོད་མི་ ལཱ་འགན་གྱི་གནོད་པ་ཚུ་ཧ་གོ་མི་འདི་གིས་ mitochondrial dysfunctionགི་སྐབས་ལུ་ རྩ་ཁམས་ཚུ་ བདག་འཛིན་འཐབ་ནི་གི་དོན་ལུ་ སྨན་བཅོས་འབད་ཚུགས་པའི་ གཞི་རྩའི་ཤེས་རྟོགས་བྱིན་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས། མ་འོངས་པའི་ཞིབ་འཚོལ་ཚུ་གིས་ ཀླདཔ་གི་ཁམས་ཕྲན་གཞན་མི་ཚུ་ནང་ལུ་ ནུས་ཤུགས་ཀྱི་བཅུད་འགྱུར་གྱི་འགྱུར་བ་ཚུ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ གཞི་རྩ་འདི་ གཞན་མི་རྩ་ཁམས་ནད་གཞི་ཚུ་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཚུགསཔ་སྦེ་ གསལ་བཏོན་འབད་དགོཔ་ཨིན།
MitoPark བྱི་ཙི་ཚུ་ ཧེ་མ་ལས་ འགྲེལ་བཤད་རྐྱབ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། (31) C57BL/6N བྱི་ཙི་ loxP flanking Mfn2 རིགས་མཚན་དང་གཅིག་ཁར་ ཧེ་མ་ལས་ འགྲེལ་བཤད་རྐྱབ་སྟེ་ཡོདཔ་ད་ (༡༨) དེ་ལས་ L7-Cre བྱི་ཙི་དང་གཅིག་ཁར་ བརྒལ་ཡོདཔ་ཨིན། (༢༣) དེ་ལས་ རིགས་མཚན་མ་འདྲ་བའི་རིགས་བརྒྱུད་འདི་ རིགས་མཚན་གཅིག་པའི་ Mfn2loxP/Mfn2loxP བྱི་ཙི་དང་གཅིག་ཁར་ འབྲེལ་འཐབ་སྟེ་ Mfn2གི་དོན་ལུ་ Purkinjeགི་རིགས་མཚན་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) འཁྲིག་སྦྱོར་གྱི་ཆ་ཤེས་ཅིག་ནང་ལུ་ Gt(ROSA26) SorStop-mito-YFP allele(stop-mtYFP)འདི་ ཁ་སྐོང་སྦེ་ འགོ་བཙུགས་ནུག(༢༠) སེམས་ཅན་གྱི་བྱ་རིམ་ཚུ་ག་ར་ ཡུ་རོ་པིན་དང་ རྒྱལ་ཡོངས་ དེ་ལས་ གཙུག་སྡེ་གི་ལམ་སྟོན་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ འབད་ཡོདཔ་དང་ འདི་ཡང་ ཇར་མ་ནི་ལུ་ཡོད་པའི་ བྱང་ཕྱོགས་རཱའིན་ཝེསཊ་ཕ་ལི་ཡ་ལུ་ཡོད་པའི་ ཨུམ་ཝེལཊ་དང་ ཝར་བུ་ཅར་ཤུཊ་གི་ ལེནཌ་སཱམ་ཕུ་ར་ནཱ་ཀྲར་གྱིས་ ཆ་འཇོག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། སེམས་ཅན་གྱི་ལཱ་འདི་ཡང་ ཡུ་རོ་པིན་བརྟག་དཔྱད་ཁང་སེམས་ཅན་གྱི་མཚོན་རིག་ཚོགས་སྡེ་གི་ལམ་སྟོན་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ཨིན།
མངལ་ཆགས་མའི་མངལ་སྒོའི་བཤག་བཅོས་འདི་ སྨན་བཅོས་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ བྱི་ཙི་གི་སྒོང་ཕྲུག་འདི་ སོ་སོ་སྦེ་བཞགཔ་ཨིན།(E13) ཀོར་ཊེགསི་འདི་ Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ནང་ལུ་ 10 mM Hepes ཁ་སྐོང་བཀལ་ཏེ་ Dulbecco གི་བཟོ་བཅོས་འབད་མི་ Eagle's Medium ནང་ལུ་ papain (20 U/ml) དང་ cysteine ​​(1μg/ml) ཡོད་པའི་བརྒྱུད་ལམ་ནང་ལུ་ བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་འདི་ DMEM ནང་ལུ་བཙུགས་ཞིནམ་ལས་ བཞུ་ཁུ་གི་ཐོག་ལས་ བཞུ་བཅུག་དགོ། Ml) སྐར་མ་༢༠ གི་རིང་ལུ་ དྲོད་ཚད་༣༧°C ལུ་བཙུགས་ཞིནམ་ལས་ འཕྲུལ་རིག་གི་ཐོག་ལས་ DMEM ནང་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་༡༠ གི་མངལ་ནང་གི་ ནོར་གྱི་ཁྲག་རྒྱུན་བླུགས་ཏེ་ བརྡུང་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཤེལ་གྱི་གདོང་ཁེབས་གུར་ལུ་ སེན་ཀྲི་མི་ཀྲར་༦གི་ལམ་སྲོལ་གྱི་ཐབ་ཚང་ནང་ལུ་ མཐུག་ཚད་༢×༡༠༦དང་ ཡང་ན་ པར་རིས་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ ཁམས་ཕྲན་༠.༥×༡༠༥/སེན་ཀྲི་མི་ཀྲར་༢གི་མཐུག་ཚད་ནང་ལུ་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ཆུ་ཚོད་༤ གི་ཤུལ་ལས་ བརྒྱུད་ལམ་འདི་ ༡% B27 ཁ་སྐོང་དང་ ༠.༥ mM GlutaMax ཡོད་པའི་ Neurobasal serum-free བརྒྱུད་ལམ་གྱིས་ཚབ་བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་ལས་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་སྐབས་ལུ་ དྲོད་ཚད་༣༧དང་ བརྒྱ་ཆ་༥གི་ CO2 ལུ་བཞག་སྟེ་ བདུན་ཕྲག་གཅིག་ནང་ཚར་གཅིག་ བཞེས་སྒོ་བྱིན་ཡོདཔ་ཨིན། ཝི་ཀྲོ་ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་མཉམ་བསྡོམ་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ གཤམ་གསལ་གྱི་ AAV9 ཕྲ་རབས་ནད་འབུཔ་གི་ 3μl (24-well culture dish) ཡང་ན་ 0.5μl (24-well plate) འདི་ ཝི་ཀྲོ་ནང་ལུ་ ཉིནམ་གཉིས་པའི་ནང་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་སྨན་བཅོས་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, ཐོ་གཞུང་ཨང་ ༡༠༥༥༣༠-AAV9) དང་ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, ཐོ་གཞུང་ཨང་ ༡༠༥༥༤༥-AAV9) བཅས་ཡིན།
བྱི་ཙི་Mfn1དང་Mfn2ལྷན་ཐབས་ཀྱི་DNA(Addgene plasmid #23212དང་ #23213ལས་ཐོབ་མི་)འདི་ C-terminusལུ་ V5གོ་རིམ་(GKPIPNPLLGLDST)གི་ཐོག་ལས་ རྟགས་བཀོད་དེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ T2Aགོ་རིམ་བརྒྱུད་དེ་ mCherryདང་གཅིག་ཁར་ མཉམ་སྦྱོར་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། Grx1-roGFP2 འདི་ ཧའི་ཌེལ་བཱརག་ ཊི་པི་ ཌིག་ ཌི་ཨེཕ་ཀེ་ཛེཌ་ (ཌའུཊ་ཤེསི་ ཀེརེབ་ཕོརསི་ཅུང་སེནཊ་རམ་) ལས་ གསོལ་རས་ཅིག་ཨིན། དང་ཕུ་གི་རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་ཀྱི་ཐབས་ལམ་ཚུ་ལག་ལེན་འཐབ་ཏེ་ tdTomato གི་སྒྲ་ཐག་འདི་ཚབ་བཙུགས་ཏེ་ pAAV-CAG-FLEX-tdTomato གི་སྒལ་ཚིགས་ནང་ལུ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-VCAV5, ཕེལེགསི་-ཨེམ་ཅེ་རི་-ཊི་༢ཨེ་-ཨེམ་ཨེཕ་ཨེན་༡-ཝི་༥ དང་ པི་ཨེ་ཨེ་ཝི་-སི་ཨེ་ཇི་-ཕེལེགསི་-ཇི་ཨར་ཨེགསི་-རོ་ཇི་ཨེཕ་པི་༢ བེག་ཊར་ཚུ། འདི་བཟུམ་གྱི་ཐབས་ཤེས་འདི་ ཚད་འཛིན་ཝེག་ཊར་ pAAV-CAG-FLEX-mCherry བཟོ་བསྐྲུན་འབད་ནི་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། AAV-shPCx བཟོ་བཀོད་བཟོ་ནིའི་དོན་ལུ་ པཱལསི་མིཌ་ཨེ་ཨེ་ཝི་ཝེག་ཊར་ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) དགོཔ་ཨིནམ་ད་ དེ་ནང་ shRNA དམིགས་གཏད་བྱི་ཙི་PCx (5′GTAGCTAGGTGAGCCTACTACTA) ཨིན་ཀོ་ཌིང་འབད་མི་ ཌི་ཨེན་ཨེ་རིམ་པ་ཡོདཔ་ཨིན། ༣′) U6 ཁྱབ་སྤེལ་གྱི་དབང་འོག་ལུ་ mCherry འདི་ CMV ཁྱབ་སྤེལ་གྱི་དབང་འོག་ལུ་ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། ལྷན་ཐབས་ཀྱི་ཨེ་ཨེ་ཝི་ཝེག་ཊར་ཚུ་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་གི་བཀོད་རྒྱ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།(Cell Biolabs) མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5) དང་ mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEXs-mCherry) འབག་མི་ བརྗེ་སོར་གྱི་པཱལསི་མིད་ཅིག་ལག་ལེན་འཐབ། (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ཡང་ན་ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) རིགས་མཚན་གྱི་གསང་རྟགས་བཀོད་ནི་དང་ དེ་ལས་ AAV1 ཀེབ་སིཌ་ཟས་བཅུད་དང་ མཐུན་རྐྱེན་ཟས་བཅུད་ཀྱི་གསང་རྟགས་བཀོད་ནི། ཕྲ་རབས་ནད་འབུཔ་གི་ཆུ་འདི་ འཁྱེག་སྐམ་/ཨི་ཐ་ནོལ་གྱི་ཆུ་ནང་ལུ་ གྱང་ཤུགས་ཅན་གྱི་འཁོར་རིམ་དང་ ཕོསི་ཕེཊ་བཱ་ཕར་ཚྭ་ཆུ་ནང་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ བཞུ་བཅུག་སྟེ་ ཐོབ་ཡོདཔ་ཨིན། AAV vector འདི་ འཕྲོ་མཐུད་མེད་པའི་ iodixanol གི་གྱེན་ཐིག་ཨཱལ་ཀྲ་སེན་ཀྲི་ཕུ་གེ་ཤཱན་གྱིས་ ༼ཆུ་ཚོད་༢༤ ༣༢༠༠༠ ཨར་པི་ཨེམ་དང་ ༤°C ལུ་༽ བཙག་འཐུ་འབད་དེ་ ཨ་མི་ཀཱོན་ཨཱལ་ཀྲ་༡༥ སེན་ཀྲི་ཕུ་གཱལ་ཚགས་མ་ལག་ལེན་འཐབ་ཏེ་ བསྡུ་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། རིགས་མཚན་གྱི་ཚད་གཞི་ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), ཨེ་ཨེ་ཝི་༡-སི་ཨེ་ཇི་-ཕེལེགསི་འདི་ ཧེ་མ་བཟུམ་སྦེ་ ཚད་འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) དང་ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) བཅས་ཡིན།
རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ འཁྱེག་གི་ནང་ལུ་ བཏོན་བཏང་ཞིནམ་ལས་ བརྒྱ་ཆ་༠.༥ Triton X-100 / བརྒྱ་ཆ་༠.༥ sodium deoxycholate/PBS lysis buffer ནང་ལུ་ phosphatase དང་ protease inhibitor (Roche) ཡོད་མི་ནང་ལུ་ གཅིག་མཚུངས་སྦེ་བཟོ་ནུག ཟས་བཅུད་ཀྱི་འབོར་ཚད་འདི་ བཱའི་སིན་ཀོ་ནིཀ་ཨེ་སིཌ་བརྟག་དཔྱད་ ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག༽ ལག་ལེན་འཐབ་ཏེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་ལས་ འཚོ་བཅུད་ཚུ་ SDS-polyaacrylamide gel electrophoresis གི་ཐོག་ལས་ ཁ་ཕྱེ་སྟེ་ དེ་ལས་ པོ་ལི་ཝི་ནི་ལི་དྲིན་ཕུའུ་རའིགྲ་གྱིབ་མ་ནང་ལུ་ བླུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ༼GE Healthcare༽ དམིགས་བསལ་མེན་པའི་ས་ཁོངས་ཚུ་བཀག་ཞིནམ་ལས་ ནུས་གཟུགས་གཙོ་བོ་དང་གཅིག་ཁར་ འཕྱེལ་འགྱོ་དགོཔ་ཨིན། +4°C ལུ་ མཚན་མོ་གཅིག་གི་རིང་ལུ་ ནུས་གཟུགས་གཙོ་བོ་དང་གཅིག་ཁར་ བཙུགས་དགོ། གཙང་སྦྲ་འབད་ཚར་བའི་ཤུལ་ལས་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ ཆུ་ཚོད་༢ ཀྱི་རིང་ གཉིས་པ་ ནད་འབུབ་བླུགས་དགོ། དེ་གི་ཤུལ་ལས་ བརྡ་རྟགས་ཅོག་འཐདཔ་འདི་ anti-β-actin antibody དང་ཅིག་ཁར་ བཙུགས་ཏེ་ ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་བཀལ་མི་འདི་ ངེས་གཏན་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། རྫས་ཁམས་འོད་མདངས་ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དེ་ རྫས་ཁམས་འོད་མདངས་ཡར་དྲག་བཏང་ཐོག་ལས་ བརྟག་དཔྱད་ (GE Healthcare)།
ཧེ་མ་ལས་ ཤེལ་གྱི་ཁ་དོག་གུར་ བཙུགས་ཡོད་པའི་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཁང་མིག་གི་དྲོད་ཚད་ནང་ སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ དུས་ཚོད་བཀོད་མི་ནང་ བརྒྱ་ཆ་༤ གི་ paraformaldehyde (PFA)/PBS གི་ཐོག་ལས་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་ཡང་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༥གི་རིང་ལུ་ ༠.༡% Triton X-100/PBS གི་ཐོག་ལས་ བཀབ་ཞིནམ་ལས་ བཀག་ཆ་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། ཉིནམ་གཉིས་པའི་ནང་ coverslips ཚུ་ བཀག་ཆ་འབད་མི་ བཱ་ཕར་གྱིས་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ ཆུ་ཚོད་༢ ཀྱི་རིང་ འོས་འབབ་ཅན་གྱི་ fluorophore-conjugated secondary antibody དང་ཅིག་ཁར་ བཀག་བཞག་ནུག། མཐའ་མཇུག་ལུ་ དཔེ་ཚད་ཚུ་ PBS ནང་ལུ་ 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) དང་ཅིག་ཁར་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ དེ་ལས་ Aqua-Poly/Mount དང་ཅིག་ཁར་ ཕྲ་མཐོང་ཆེ་ཤེལ་གྱི་བཤུད་བརྙན་གུར་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན།
བྱི་ཙི་(ཕོ་མོ་) ཚུ་ ཀེ་ཊ་མིན་(༡༣༠ ཨེམ་ཇི་/ཀེ་ཇི་) དང་ ཟའི་ལ་ཛིན་(༡༠ ཨེམ་ཇི་/ཀེ་ཇི་) གི་སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་བཅོས་འབད་དེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ཏེ་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་ནུག། མགུ་ཏོ་འདི་ ཕྱི་ཁར་བཏོན་ཞིནམ་ལས་ སོ་གི་སྦྱོང་བརྡར་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ རུ་ཏོ་གི་ཆ་ཤས་འདི་ ཕྲང་ཏང་ཏ་བཟོ་དགོཔ་ཨིན། འོག་ལུ་ཡོད་པའི་ ཁྲག་རྒྱུན་ལུ་ བར་ཆད་མ་འབྱུང་ནི་གི་དོན་ལུ་ མགུ་ཏོ་ནང་ དོང་ཆུང་ཀུ་ཅིག་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ བཟོ་ནིའི་དོན་ལུ་ གུག་གུགཔ་འབད་མི་ སྨན་ཁབ་ཀྱི་ སྨན་ཁབ་ཅིག་ ལག་ལེན་འཐབ། དེ་ལས་ ཤེལ་གྱི་མཆིནམ་འདི་ འགོར་ལས་སྦེ་ མའི་ཀོརོ་ཧོལ་ནང་ལུ་བཙུགས་ཏེ་ ༼ཌུ་ར་མེ་ཊར་གྱི་ མཆིནམ་ཕྱོགས་ལུ་ -༡.༣ ལས་ -༡ ཚུན་༽ ༢༠༠ ལས་༣༠༠ ཨེན་ཨེལ་ཨེ་ཨེ་ཝི་འདི་ མའི་ཀོརོ་ཨིན་ཇེག་ཊར་ནང་ལུ་ བཙུགས་དགོཔ་ཨིན། སྐར་མའི་སྒེའུ་ཁུང་། བཙུགས་ཚར་བའི་ཤུལ་ལས་ ནད་འབུབ་འདི་ ཡོངས་རྫོགས་སྦེ་ ཁྱབ་སྤེལ་འགྱོ་བཅུག་ནིའི་དོན་ལུ་ ཁྲག་རྒྱུན་འདི་ ད་རུང་སྐར་མ་༡༠ དེ་ཅིག་ བཞག་དགོ། ཁྲག་རྒྱུན་ཚུ་ བཏོན་བཏང་པའི་ཤུལ་ལས་ རྨ་འདི་ མར་ཕབ་འབད་དེ་ སེམས་ཅན་འདི་ དྲག་ཚུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ པགས་ཀོ་འདི་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ བཙེམ་དགོཔ་ཨིན། སེམས་ཅན་ཚུ་ བཤག་བཅོས་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ ཉིནམ་དག་པ་ཅིག་གི་རིང་ལུ་ ན་ཟུག་འཇོམས་བྱེད་ཀྱི་སྨན་ ༼caspofen༽ གི་ཐོག་ལས་ སྨན་བཅོས་འབད་ཡོདཔ་དང་ དེ་བསྒང་ ཁོང་གི་གཟུགས་ཀྱི་གནས་སྟངས་འདི་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་བལྟ་ཞིབ་འབད་དེ་ དུས་ཚོད་བཀོད་མི་ནང་ བསད་ཡོདཔ་ཨིན། བྱ་རིམ་ཚུ་ག་ར་ ཡུ་རོ་པིན་དང་ རྒྱལ་ཡོངས་ དེ་ལས་ གཙུག་སྡེ་གི་ལམ་སྟོན་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ འགོ་འདྲེན་འཐབ་ཡོདཔ་ད་ དེ་ཡང་ ཇར་མ་ནི་གི་ བྱང་ཕྱོགས་རཱའིན་ཝེསཊ་ཕ་ལི་ཡ་གི་ ཨུམ་ཝེལཊ་དང་ ཝར་བུ་ཅར་ཤུཊ་གི་ ལེནཌ་སམ་ཊི་ཕུ་ར་ནཱ་ཊར་གྱིས་ ཆ་འཇོག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
སེམས་ཅན་ཚུ་ལུ་ ཀེ་ཊ་མིན་ (༡༠༠ ཨེམ་ཇི་/ཀེ་ཇི་) དང་ ཟའི་ལ་ཟིན་ (༡༠ ཨེམ་ཇི་/ཀེ་ཇི་) གིས་ སྨན་བཅོས་འབད་དེ་ སེམས་ཁར་ དང་པ་ ༠.༡ ཨེམ་ པི་བི་ཨེསི་ བླུགས་ཞིནམ་ལས་ དེ་ལས་ པི་བི་ཨེསི་ནང་ ༤% པི་ཨེཕ་ཨེ་ བླུགས་ཡོདཔ་ཨིན་པས། ཁམས་ཕྲན་འདི་ བཤག་བཅོས་འབད་དེ་ ༤% PFA/PBS ནང་ལུ་ མཚན་མོ་གཅིག་གི་རིང་ལུ་ ༤°C ལུ་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། དར་ཁྱབ་ཅན་གྱི་གྲི་ ༼Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria༽ འདི་ PBS ནང་ལུ་ ཀླདཔ་གཏན་གཏན་ཅིག་ལས་ མདའ་རྩེདཔ་གི་ཆ་ཤས་ ༼སྟུག་ཚད་༥༠ μm༽ བཟོ་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་མེན་པ་ཅིན་ རང་དབང་ཅན་གྱི་འཕྱོ་བའི་དབྱེ་ཁག་ཚུ་ གོང་ལས་བཤད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ (༡༣) ཁང་མིག་གི་དྲོད་ཚད་དང་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། མདོར་བསྡུས་ན་ དང་པ་ ཐོབ་པའི་ ཆ་ཤས་ཚུ་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ སྐར་མ་༡༥ གི་རིང་ལུ་ ༠.༥% Triton X-100/PBS དང་ཅིག་ཁར་ བརྡལ་བཤིག་གཏང་ཡོདཔ་ཨིན། ༼Pcx དང་ Shmt2༽ ལ་ལུ་ཅིག་གི་དོན་ལུ་ tris-EDTA buffer 80°C (PH 9) ལུ་ འདི་གི་ཚབ་ལུ་ སྐར་མ་༢༥ གི་རིང་ལུ་ དྲོད་བཏགས་དགོ། དེ་ལས་ དབྱེ་ཁག་ཚུ་ ནུས་གཟུགས་གཙོ་བོ་དང་གཅིག་ཁར་ ༼ཐིག་ཁྲམ་S1 བལྟ་༽ བཀག་ཆ་འབད་མི་ བཱ་ཕར་ (3% BSA/PBS) ནང་ལུ་ 4°C ལུ་ ནུབ་མོ་གཅིག་གི་རིང་ལུ་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དེ་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་གི་ནངས་པ་ དབྱེ་ཁག་ཚུ་ བཀག་ཆ་འབད་མི་ བཱ་ཕར་གྱིས་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ ཆུ་ཚོད་༢ ཀྱི་རིང་ འོས་འབབ་ཅན་གྱི་ ཕུའུ་རོ་ཧོར་ ཀོན་ཇུ་གེ་ཊེཌ་ གཉིས་པ་ ནུས་གཟུགས་དང་གཅིག་ཁར་ བཀག་བཞག་ནུག། མཐའ་མཇུག་ཁར་ དབྱེ་ཁག་ཚུ་ PBS ནང་ལུ་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ DAPI གི་ཐོག་ལས་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཞིནམ་ལས་ AquaPolymount གི་ཐོག་ལས་ ཕྲ་གཟུགས་ཤེལ་གྱི་བཤུད་བརྙན་ནང་ལུ་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན།
དཔེ་ཚད་འདི་པར་བཏབ་ནི་གི་དོན་ལས་ འོད་དཀརཔོ་གི་འོད་འཕྲོ་དང་ ༤༠༥ ཌའི་ཨོཌ་ཨཱལ་ཀྲ་ཝའི་ཨོ་ལེཊ་འོད་འཕྲོ་ཚུ་ བཙུགས་ཏེ་ཡོད་མི་ འོད་འཕྲོའི་པར་བཏབ་མི་ ཀོན་ཕོ་ཀཱལ་ཕྲ་གཟུགས་མཐོང་ཆས་ ༼ཀྲི་སི་ཨེསི་ཨེསི་པི་༨-ཨེགསི་ ཡང་ན་ ཀྲི་སི་ཨེསི་དྲི་ཇི་ཀྲལ་འོད་ཀྱི་ཤོག་ལེབ་ ལེ་ཀ་མའི་ཀོརོ་སི་སི་ཊམ་༽ འདི་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཕུའུ་རོ་ཕོར་འདི་ སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་བཅུག་སྟེ་ ཧའིབ་རིཌ་བརྟག་དཔྱད་འཕྲུལ་ཆས་(HyDs)གི་ཐོག་ལས་ བརྡ་མཚོན་བསྡུ་ལེན་འབད་མི་འདི་གིས་ LAS-Xམཉེན་ཆས་འདི་ Nyquistདཔེ་ཚད་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ པར་ཚུ་བསྡུ་སྒྲིག་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ནུག BrightR ཐབས་ལམ།). རྒྱབ་གཞི་མར་ཕབ་འབད་ནི་ལུ་ ༠.༣ ལས་ ༦ ns གི་གེ་ཊིང་འདི་འཇུག་སྤྱོད་འབདཝ་ཨིན།
དབྱེ་སེལ་འབད་ཡོད་པའི་ནང་ཐིག་ཚུ་གི་ དུས་ཚོད་ངོ་མའི་པར་བརྙན། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ བརྒྱ་ཆ་༡ བི་༢༧ དང་ ༠.༥ ཨེམ་ཨེམ་གུ་ལུ་ཊ་མེགསི་ཡོད་པའི་ ནེའུ་རོ་བཱ་སཱལ་-ཨེ་བརྒྱུད་ལམ་ནང་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ཞིནམ་ལས་ དེ་འཕྲོ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཤེལ་གྱི་བཤུད་ཤོག་གུར་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། གཞིས་ཆགས་ནི། དུས་ཚོད་ངོ་མའི་པར་བཏབ་ནི་འདི་ Leica SP8 ལེ་ཟར་ཨིསི་ཀེན་ཀོན་ཕོ་ཀཱལ་ཕྲ་མཐོང་ཆེ་ཤེལ་གུར་ལུ་ ལེ་ཟར་དཀརཔོ་ HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] མར་ཁུ་དམིགས་གཏད་ཀྱི་མིག་ཤེལ་དང་ དྲོད་བཏགས་གནས་རིམ་ཚུ་བཙུགས་ཏེ་ཡོདཔ་ཨིན།
བྱི་ཙི་འདི་ མགྱོགས་པ་རང་ ནག་རླུང་གིས་ སྨན་བཅོས་འབད་དེ་ མགུ་ཏོ་བཏོག་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ཀླདཔ་འདི་ མགུ་ཏོ་ལས་ མགྱོགས་པ་རང་ བཏོན་ཞིནམ་ལས་ མཐུག་ཚད་ ༢༠༠μm ལུ་བཏོག་ཡོདཔ་ཨིན། ཚན་རིག་ཁང་། ཝལ་ཌོརཕ། ཇར་མན།) གཤམ་གསལ་གྱི་རྫས་སྦྱོར་གྱིས་བཀང་ཡོད། 125 mM འཁྱགས་བསིལ་དང་། ནག་རྫས་ཚང་བའི་ (95% O2 དང་ 5% CO2) དམའ་བའི་ Ca2 + བཅོས་མའི་ཀླད་པའི་སྒལ་ཚིགས་ཆུ་ (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM bufferm2, 1.25 mM sodium pho5s, གུ་གུལ་ ༠.༥ mM CaCl2 དང་ ༣.༥ mM MgCl2 (310 ནས་ 330 mmol བར། ཐོབ་པའི་ཀླད་པའི་ཆ་ཤས་ཚུ་ Ca2 + ACSF མཐོ་དྲགས་ཡོད་པའི་ སྔོན་འགོག་ཁང་མིག་ནང་ སྤོ་བཤུད་འབད། MgCl2) བར་མ) pH 7.4 དང་ 310 ནས་ 320 mmol) ཡིན།
པར་རིས་བཟོ་བའི་སྐབས་ལུ་ ཆ་ཤས་ཚུ་ དམིགས་བསལ་གྱི་པར་རིས་ཁང་མིག་ནང་ལུ་སྤོ་བཤུད་འབད་དེ་ བརྟག་དཔྱད་འདི་ དྲོད་ཚད་༣༢ལས་༣༣གི་བར་ན་ལུ་ འཕྲོ་མཐུད་དེ་རང་ ACSF བླུགས་ཏེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། པར་རིས་ཚུ་བཏབ་ནི་གི་དོན་ལས་ ལེ་ཀ་༢༥ཨེགསི་དམིགས་གཏད་ཀྱི་མིག་ཤེལ་ ༼ཨེན་ཨེ་༠.༩༥ ཆུ་༽ དང་ ཀྲི་ སེ་ཕི་ཡར་འོད་འཕྲོ་ ༼ཅེ་མེ་ལིའོན་ཝི་ཛིན་༢ ཀོ་ཧེརེནཀྲ༽ ཚུ་བཙུགས་ཏེ་ཡོད་མི་ མལ་ཀྲི་ཕོ་ཀྲོན་ལེ་ཟར་ཨིསི་ཀེན་ཕྲ་མཐོང་ཆེ་ཤེལ་ ༼ཀྲི་སི་ཨེསི་ཨེསི་པི་༨ ཨེམ་པི་ཨོ་པི་ཨོ་ ལེའི་ཀ་མའི་ཀོརོ་སི་སི་ཀྲམ་༽ འདི་ཚུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། FLIM ཚད་གཞི་ (པི་ཀོ་ཧརཔ་༣༠༠, པི་ཀོ་ཀོཝན་ཊི)།
Grx1-roGFP2 གི་ FLIM ཨིན། PNsགི་ cytoplasmic redoxགནས་སྟངས་ཀྱི་འགྱུར་བ་འདི་ ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ནང་ལུ་ photon FLIMགཉིས་ཀྱི་ཐོག་ལས་ འཇལ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ནང་ལུ་ Grx1-roGFP2གི་སྐྱེ་ལྡན་ཚོར་འཕྲུལ་གྱིས་ PNsལུ་དམིགས་གཏད་བསྐྱེད་ནུག PNབང་རིམ་ནང་ལུ་ མཁོ་སྒྲུབ་ཀྱི་ས་སྒོ་འདི་ ཁ་ཐོག་གི་འོག་ལུ་ ༥༠ལས་༨༠གི་བར་ན་ གདམ་ཁ་རྐྱབ་སྟེ་ PNཡོདཔ་སྦེ་ངེས་གཏན་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ཨིན་མས། mཅེ་རི།). 2x ཌི་ཇི་ཊལ་ཆེར་བསྐྱེད་དང་གཅིག་ཁར་ བང་རིམ་རྐྱང་པའི་པར་རིས་ཚུ་བསྡུ་ལེན་འབད། [excitation wavelength: 890 nm; ༥༡༢ nm ༥༡༢ པིག་སེལ།] བརྟག་དཔྱད། ནང་འཁོད་ཀྱི་HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) ཚགས་མ་སྡེ་ཚན་] དང་ སྐར་མ་༢ ལས་༣ གྱི་ནང་འཁོད་ལུ་ པར་རིས་ཆ་སྙོམས་ཚུ་ གུག་གུགཔ་སྒྲིག་ནིའི་དོན་ལུ་ ཕོ་ཊོན་ལངམ་སྦེ་བསྡུ་སྒྲིག་འབད་ཚུགསཔ་བཟོ་ནི་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། Grx1-roGFP2 འཚོལ་ཞིབ་ཀྱི་ཚོར་ཤུགས་དང་ FLIM གནས་སྟངས་ཀྱི་བདེན་དཔྱད་འདི་ roGFP2 གི་ཚེ་སྲོག་གི་གནས་གོང་འདི་ བལྟ་རྟོག་འབད་དེ་ ཕྱི་ཡི་ 10 mM H2O2 འདི་ ACSF ལུ་ཁ་སྐོང་བཀོད་པའི་སྐབས་ལུ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། མར་ཕབ་འབད་དེ་ མི་ཚེའི་ཚད་གཞི་མར་ཕབ་འགྱོཝ་ཨིན།) (པར་རིས་ S8, D to G). འདོན་སྤེལ།: ༢༠༡༡/༠༤/༢༠ རིག་པ།(༡) འབྲུག་རྒྱང་བསྒྲགས་ལས་ཁུངས་ཀྱིས་ འབྲུག་རྒྱང་བསྒྲགས་ལས་ཁུངས་ལུ་ བརྡ་དོན་འཕྲུལ་རིག་དང་འབྲེལ་བའི་ ལས་རིམ་ཚུ་ འགོ་འདྲེན་འཐབ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། འབོར་ཚད་ཀྱི་དོན་ལུ་ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན།
Mitochondrial འོས་འབབ་དབྱེ་དཔྱད། ཚབས་ཆེན་གྱི་དབྱེ་ཁག་འདི་ ༡༠༠nM TMRM དང་ཅིག་ཁར་ སྐར་མ་༣༠གི་རིང་ལུ་ ཐད་ཀར་དུ་ ACSF ལུ་ཁ་སྐོང་བཀོད་པའི་ཤུལ་ལས་ PNs གི་ mitochondrial འོས་འབབ་འགྱུར་བ་འདི་ ཕོ་ཊོན་ཕྲ་གཟུགས་མཐོང་ཆས་གཉིས་ཀྱི་ཐོག་ལས་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། TMRM པར་རིས་འདི་ 920 nm ལུ་ འཚོལ་ཞིབ་འབད་མི་འདི་ སེམས་དགའ་བཅུག་སྟེ་ ནང་འཁོད་ HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བརྡ་མཚོན་བསྡུ་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། mtYFP གི་པར་རིས་ལུ་ འཕར་ཚད་རླབས་ཀྱི་ཐག་ཚད་གཅིག་པ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ནང་འཁོད་ཀྱི་ HyD (FITC :525/50) སོ་སོ་ཅིག་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་གཅིག་གི་གནས་རིམ་ནང་ མའི་ཊོ་ཀོན་ཌི་ཡལ་འོས་འབབ་བརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་ལུ་ ImageJ གི་པར་རིས་རྩིས་འཕྲུལ་པ་ལག་ཨིན་ལག་ལེན་འཐབ། མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ པ་ལག་ཨིན་སྙོམ་རྩིས་: བརྡ་མཚོན་ = min (mtYFP, TMRM) འདི་ འབྲེལ་ཡོད་རྒྱུ་ལམ་གྱི་ བང་རིམ་གཅིག་གི་ ཀོན་ཕོ་ཀཱལ་པར་རིས་ནང་ Purkinje Somali ལུ་ TMRM བརྡ་མཚོན་སྟོན་མི་ mitochondrial ལུང་ཕྱོགས་ངོས་འཛིན་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། དེ་ལས་ གྲུབ་འབྲས་ཐོན་མི་ གདོང་ཁེབས་ནང་ལུ་ པིག་སེལ་གྱི་ས་སྒོ་འདི་ འཇལ་ཞིནམ་ལས་ mtYFPགི་རྒྱུན་ལམ་གྱི་པར་རིས་ཅིག་གུ་ལུ་ སྤྱིར་བཏང་སྦེ་བཟོ་སྟེ་ mitochondrialགི་འོས་འབབ་སྟོན་མི་ mitochondrialགི་དཔྱ་རྩིས་ཐོབ་ཚུགསཔ་ཨིན་མས།
པར་རིས་འདི་ Huygens Pro ༼མཚོན་རིག་གི་སྐད་ཤུགས་པར་རིས་༽ མཉེན་ཆས་འདི་གི་ཐོག་ལས་ བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། ཊ་ཡིལ་ཚུ་གི་ པར་ལོག་བཏབ་ཡོད་པའི་པར་ཚུ་གི་དོན་ལུ་ ཊ་ཡིལ་གཅིག་གི་ མོན་ཊེཇ་འདི་ ཨེལ་ཨེསི་-ཨེགསི་མཉེན་ཆས་ཀྱིས་ རང་བཞིན་གྱི་ བཙུགས་ནིའི་ཨཱལ་གོ་རི་དམ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བཟོཝ་ཨིན། པར་རིས་ཚད་འཇལ་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ པར་རིས་འདི་ ལྷག་པར་དུ་ ལས་སྦྱོར་འབད་ནི་དང་ འོད་མདངས་དང་ ཁྱད་པར་གཅིག་མཚུངས་སྦེ་ བདེ་སྒྲིག་འབད་ནི་ལུ་ ImageJ དང་ Adobe Photoshop ལག་ལེན་འཐབ། ཚད་རིས་གྲ་སྒྲིག་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ཨེ་ཌོབ་པར་རིས་ལག་ལེན་འཐབ།
mtDNA དམིགས་གཏད་དབྱེ་ཞིབ། mtDNAགི་ནད་གཞི་གི་གྱངས་ཁ་འདི་ cerebellarགི་ཆ་ཤས་ནང་ལུ་ DNAལུ་འགོག་པའི་ནུས་གཟུགས་ཡོདཔ་སྦེ་ confocal microscopeགི་ཐོག་ལས་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། དམིགས་གཏད་ས་ཁོངས་རེ་རེ་བཞིན་དུ་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་གཟུགས་དང་ ཁམས་ཕྲན་རེ་རེ་གི་རྡུལ་ཕྲན་གྱི་དོན་ལུ་ བཟོ་ཡོདཔ་ད་ རང་སོའི་ས་ཁོངས་ཚུ་ སྣ་མང་འཇལ་ཚད་པ་ལག་ཨིན་ (ImageJ software) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ རྩིས་རྐྱབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་གྱི་གཟུགས་ཀྱི་ས་ཁོངས་ལས་ རྡུལ་ཕྲན་གྱི་ས་ཁོངས་ཕབ་སྟེ་ cytoplasmic ས་ཁོངས་ཐོབ་དགོ། མཐའ་མཇུག་ཁར་ Analysis Particles plug-in (ImageJ software) འདི་ རང་བཞིན་གྱིས་ mtDNA གི་ས་སྒོ་ཚུ་ ཚད་འཇལ་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་དང་ ཐོབ་པའི་གྲུབ་འབྲས་ཚུ་ CTRL བྱི་ཙི་གི་ PN སྤྱིར་སྙོམས་ལུ་ སྤྱིར་བཏང་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། གྲུབ་འབྲས་འདི་ ཁམས་ཕྲན་རེ་ལུ་ སྤྱིར་སྙོམས་ལུ་ ནིའུ་ཀིའོ་སའིཌ་གི་གྱངས་ཁ་སྦེ་ བརྡ་སྟོནམ་ཨིན།
ཟས་བཅུད་བརྡ་སྟོན་དབྱེ་དཔྱད། ནང་ཐིག་རྐྱང་པའི་གནས་རིམ་ནང་ པི་ཨེན་ནང་ ཟས་བཅུད་བརྡ་སྟོན་བརྟག་ཞིབ་འབད་ནི་ལུ་ པར་རིས་ཇེ་གི་པར་རིས་རྩིས་འཕྲུལ་པ་ལག་ཨིན་ལག་ལེན་འཐབ། མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ བང་རིམ་གཅིག་གི་ བང་རིམ་ནང་ལུ་ སྙོམ་རྩིས་བརྒྱུད་དེ་ བརྡ་མཚོན་ = min (mtYFP, antibody) ཟེར་མི་ mitochondrial གི་ས་སྒོ་འདི་ Purkina ལུ་ཡོད་པའི་ ནུས་གཟུགས་ཅིག་ལུ་ ནད་འབུཔ་བཀག་ཐབས་འབད་མི་འདི་ ངོས་འཛིན་འབདཝ་ཨིན་མས། དེ་ལས་ གྲུབ་འབྲས་ཐོན་མི་ཁ་རས་ནང་ལུ་ པིག་སེལ་གྱི་ས་སྒོ་འདི་ འཇལ་ཞིནམ་ལས་ mtYFP རྒྱུན་ལམ་གྱི་ པར་རིས་ཅིག་གུ་ལུ་ སྤྱིར་བཏང་སྦེ་བཟོ་སྟེ་ བཀྲམ་སྟོན་འབད་མི་ ཟས་བཅུད་ཀྱི་ mitochondrial དཔྱ་རྩིས་འདི་ཐོབ་ཚུགསཔ་ཨིན།
Purkinje ཁམས་ཕྲན་གྱི་མཐུག་ཚད་དབྱེ་དཔྱད། ImageJ གི་ Cell Counter plug-in འདི་ Purkinje གི་མཐུག་ཚད་དབྱེ་ཞིབ་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ རྩིས་རྐྱབ་མི་ Purkinje ཁམས་ཕྲན་གྱི་གྱངས་ཁ་འདི་ cerebellar ring གི་རིང་ཚད་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ བགོ་བཤའ་རྐྱབ་སྟེ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན།
དཔེ་ཚད་གྲ་སྒྲིག་དང་བསྡུ་ལེན། ཚད་འཛིན་སྡེ་ཚན་དང་ Mfn2cKO བྱི་ཙི་གི་ཀླདཔ་འདི་ ༠.༡ M phosphate buffer (PB) ནང་ལུ་ ༢% PFA/༢.༥% glutaraldehyde ནང་ལུ་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཡོདཔ་ད་ དེ་ལས་ མགུ་ཏོ་གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ ciliates ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། ཊེ་ཊ་ཨོག་སའིཌ་དང་ ༡.༥% པོ་ཊ་སི་ཡམ་ཕེ་རོ་སི་ཡ་ནའིཌ་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ཆུ་ཚོད་ ༡ རིང་བཞག་དགོ། དབྱེ་ཁག་ཚུ་ ཆུ་བཙག་འཐུ་འབད་དེ་ ཚར་གསུམ་བཤལ་ཞིནམ་ལས་ སྐར་མ་༢༠ གི་རིང་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་༧༠ གི་ཨི་ཐ་ནོལ་ནང་ བརྒྱ་ཆ་༡ གི་ uranyl acetate ཡོད་མི་འདི་གིས་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་ལས་ དབྱེ་ཁག་ཚུ་ ཆང་ནང་ལུ་ ཆུ་མེདཔ་བཟོ་སྟེ་ Durcupan ACM ༼Araldite casting resin M༽ epoxy resin ༼Electron Microscopy Sciences, catalogue number 14040༽ ནང་ལུ་བཙུགས་ཏེ་ མཐའ་མཇུག་ཁར་ དྲོད་ཚད་༦༠གི་ནང་ལུ་ ཐབ་ཚང་ནང་ལུ་ Polymerize 48 ours ནང་ལུ་བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ཀླདཔ་གི་མགུ་ཏོ་གི་ས་སྒོ་འདི་འདམ་ཁ་རྐྱབ་སྟེ་ Leica Ultracut ༼Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria༽ གི་ཐོག་ལུ་ 50 nm གི་སྲབ་ཤོག་ཤོ་གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ བཏོག་ཞིནམ་ལས་ 2×1 mm གི་ཟངས་ཀྱི་ དྲྭ་མིག་གུར་ལུ་ polystyrene གི་གློག་བརྙན་གྱིས་བཀབ་ཡོདཔ་ཨིན། དབྱེ་ཁག་ཚུ་ སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ H2O ནང་ བརྒྱ་ཆ་༤ གི་ uranyl acetate གི་ཐབས་ཤེས་ཀྱིས་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཞིནམ་ལས་ H2O གིས་ ཚར་ལེ་ཤ་ཅིག་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ Reynolds lead citrate གིས་ H2O ནང་ ཚར་ལེ་ཤ་ཅིག་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ H2O གིས་ ཚར་ལེ་ཤ་ཅིག་ བཀྲུ་དགོཔ་ཨིན། ཕྲ་གཟུགས་པར་རིས་ཚུ་ བརྒྱུད་འཕྲིན་གློག་རྫས་ཕྲ་གཟུགས་མཐོང་ཆས་ ཕི་ལིཔསི་སི་ཨེམ་༡༠༠ ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག་ ཝལ་ཐམ་ ཨེམ་ཨེ་ ཡུ་ཨེསི་ཨེ་༽ གི་ཐོག་ལས་ ཀྲི་ཝི་པི་ཨེསི་ ༼ཀྲིཊ་ཟི་བརྙན་འཕྲིན་དང་པར་རིས་བཟོ་སྦྱོར་ལམ་ལུགས་༽ ཀྲེམ་ཀེམ་-ཨེཕ་༤༡༦ དྲི་ཇི་ཊལ་པར་ཆས་ ༼ཀྲི་ཝི་པི་ཨེསི་ཇི་ཨེམ་བི་ཨེཆ་ གཱའུ་ཀྲིང་ ཡུ་ཨེསི་ཨེ་༽ ལག་ལེན་འཐབ་ཏེ་ བཏབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཇར་མ་ནི་)།
AAV ནད་འབུབ་ཐོབ་མི་བྱི་ཙི་ཚུ་གི་དོན་ལས་ ཀླདཔ་འདི་ ཁ་ཕྱེ་སྟེ་ མི་ལི་མི་ཊར་༡ གི་སྦོམ་ཆུང་གི་ས་སྒོ་ནང་ལུ་ བཏོག་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ཀླདཔ་འདི་ འོད་མདངས་ཕྲ་མཐོང་ཆེ་ཤེལ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ AAV ནད་འབུབ་ཐོབ་མི་གི་སྒོར་ཐིག་འདི་ངོས་འཛིན་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། བརྟག་དཔྱད་འདི་ནང་ལུ་ AAV བཙུགས་མི་འདི་གིས་ Purkinje ཁམས་ཕྲན་བང་རིམ་གྱི་ བརྡ་སྤྲོད་ཀྱི་ཇོན་ཐངས་འདི་ གནམ་མེད་ས་མེད་མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཐོན་ཡོདཔ་ཨིན། AAV-transduced loop འདི་ མཚན་མོ་གཅིག་གི་རིང་ལུ་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་བའི་ཤུལ་ལས་ ༼༤% PFA དང་ ༢.༥% glutaraldehyde ༠.༡ M cocoate buffer ནང་ལུ་༽ དེ་ལས་ ལྷག་པར་དུ་ ལས་སྦྱོར་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། EPON བཙུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ གཏན་འཇགས་ཀྱི་ རྩ་ཕྲན་འདི་ ༠.༡ M སོ་དྲི་ཡམ་ཀོ་ཀོཊ་བཱ་ཕར་ (Applichem) གི་ཐོག་ལས་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ ༢% OsO4 (os, Science Services; Caco) དང་གཅིག་ཁར་ ༠.༡ M སོ་དྲི་ཡམ་ཀོ་ཀོཊ་བཱ་ཕར་ (Applichem) ཆུ་ཚོད་༤ གི་རིང་ལུ་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ ཆུ་ཚོད་༢ གི་རིང་ལུ་ བཀྲུ་དགོཔ་ཨིན། 0.1 M cocamide buffer དང་ཅིག་ཁར་ ཚར་ ༣ བསྐྱར་ལོག་འབད། འདི་གི་ཤུལ་ལས་ ཨི་ཐ་ནོལ་གྱི་ཐབས་ཤེས་འདི་ དྲོད་ཚད་༤གི་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༥གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་ཏེ་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ ཆུ་མེདཔ་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་འདི་ propylene oxide ལུ་སྤོ་བཤུད་འབད་དེ་ དྲོད་ཚད་༤°C ལུ་ EPON (Sigma-Aldrich) ནང་ལུ་ མཚན་མོ་གཅིག་གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་འདི་ ཆུ་ཚོད་༢ ཀྱི་རིང་ལུ་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ EPON གསརཔ་ནང་བཙུགས་ཞིནམ་ལས་ ཆུ་ཚོད་༧༢ གི་རིང་ལུ་ དྲོད་ཚད་༦༢°C ལུ་བཙུགས་དགོ། ༼Leica Microsystems, UC6༽ དང་ རྡོ་རྗེ་ཕ་ལམ་གྱི་གྲི་ ༼Diatome, Biel, Switzerland༽ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ༧༠ nm གི་ ultrathin ཆ་ཤས་ཚུ་བཏོག་ཞིནམ་ལས་ ༡.༥% uranyl acetate གི་ཐོག་ལས་ སྐར་མ་༡༥ གི་རིང་ལུ་ ༣༧°C ལུ་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཞིནམ་ལས་ སྐར་མ་༤ གི་རིང་ལུ་ ལིཌ་སི་ཀྲེཊ་ཐབས་ཤེས་ཀྱིས་ ཚོས་གཞི་བཏང་དགོ། གློག་རྫས་ཕྲ་གཟུགས་པར་རིས་ཚུ་ པར་ཆས་ཝན་ཝིའུ་༤ཀེ་༡༦-བིཊ་ (གཱ་ཊན་) དང་ ཌི་ཇི་ཊལ་མའི་ཀོརོ་གཱརཕ་མཉེན་ཆས་ (གཱ་ཏན་) ཚུ་ བཙུགས་ཏེ་ཡོད་མི་ ཇེ་ཨི་ཨེམ་-༢༡༠༠ པ་ལཱསི་ བརྒྱུད་འཕྲིན་གློག་རྫས་ཕྲ་གཟུགས་མཐོང་ཆས་ (ཇེ་ཨི་ཨོ་ཨེལ་) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན་པས། དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ གློག་རྫས་ཕྲ་གཟུགས་པར་རིས་ཚུ་ ༥༠༠༠× ཡང་ན་ ༡༠༠༠༠× དྲི་ཇི་ཊལ་ཆེར་བསྐྱེད་ཀྱི་ཐོག་ལས་ ཐོབ་ཡོདཔ་ཨིན།
mitochondria གི་སྲོག་ཆགས་རིག་པའི་དབྱེ་དཔྱད། དབྱེ་དཔྱད་ག་རའི་དོན་ལུ་ mitochondriaརེ་རེ་གི་ངོས་ཐིག་འདི་ ImageJམཉེན་ཆས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ལག་ཐོག་ལས་ པར་རིས་ནང་ལུ་བཀོད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། རིགས་མཚན་གྱི་ཚད་གཞི་སོ་སོ་ཚུ་དབྱེ་དཔྱད་འབདཝ་ཨིན། མའི་ཊོ་ཀོན་ཌི་ཡལ་གྱི་མཐུག་ཚད་འདི་ ཁམས་ཕྲན་རེ་རེའི་ མའི་ཊོ་ཀོན་ཌི་ཡལ་གྱི་ས་ཁོངས་ཡོངས་བསྡོམས་འདི་ སའི་ཊོ་པཱལསི་གི་ས་སྒོ་གིས་ བགོ་བཤའ་རྐྱབ་སྟེ་ བརྒྱ་ཆའི་ཐོག་ལས་ བརྡ་སྟོནམ་ཨིན། mitochondriaགི་ ista morphologyའདི་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་དེ་ དབྱིབས་ངོ་མ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ དབྱེ་ཁག་གཉིས་ལུ་དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན།
Autophagosome/lysosome གྱངས་ཁ་དང་ མཐུག་ཚད་དབྱེ་ཞིབ། ཌི་ཇི་ཊཱལ་པར་རིས་ནང་ ཨོ་ཊོ་ཕ་གོ་སོམ་/ལའི་སོ་སོམ་རེ་རེ་གི་ ངོས་ཐིག་ཚུ་ ལག་ཐོག་ལས་ བཀོད་སྒྲིག་འབད་ནི་ལུ་ ImageJ མཉེན་ཆས་ལག་ལེན་འཐབ། Autophagosome/lysosome གི་ས་སྒོ་འདི་ ཁམས་ཕྲན་རེ་རེ་གི་ autophagosome/lysosome གི་ས་སྒོ་ཡོངས་བསྡོམས་འདི་ cytoplasm གི་ས་སྒོ་གིས་ བགོ་བཤའ་རྐྱབ་སྟེ་ བརྒྱ་ཆའི་ནང་ལུ་ བརྡ་སྟོནམ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་རེ་ལུ་ རང་བཞིན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་/ལའི་སོ་སོམ་གྱི་བཟོ་བཀོད་ཀྱི་གྱངས་ཁ་བསྡོམས་རྩིས་བགོ་བཤའ་རྐྱབ་སྟེ་ རྩིས་རྐྱབ་ཨིན།
ཚབས་ཆེན་གྱི་དབྱེ་ཁག་དང་དཔེ་ཚད་གྲ་སྒྲིག་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ཁ་ཡིག་བཏགས་ནི། གུ་རུ་གི་ཁ་ཡིག་བཏགས་དགོ་པའི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ ནག་རྫས་ཚངམ་སྦེ་ཡོད་མི་ ༼༩༥% O2 དང་ ༥% CO2༽ དང་ Ca2 + ACSF ༼༡༢༥.༠ mM NaCl, ༢.༥ mM KCl, ༡.༢༥ mM sodium m3O, ༡.༢༥ mM sodium phos5te༽ ཚུ་ཡོད་པའི་ འཕེལ་འགྱུར་གྱི་ཧེ་མའི་ཁང་མིག་ནང་ལུ་སྤོ་བཤུད་འབད་དགོ། 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl 2 དང་ 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 དང་ 310 ནས་ 320 mOsm བར་བསྒྱུར་བཅོས་བྱས་ཡོད། pyruvate རྟགས་བཀོད་དགོ་པའི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཀླདཔ་གི་ཆ་ཤས་ཚུ་ Ca2 + ACSF མཐོ་དྲགས་ལུ་སྤོ་བཤུད་འབད་དགོ། MgCl2, pH 7.4 དང་ 310 ནས་ 320mOsm ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དེ་ 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, ཐོ་གཞུང་ཨང་ CLM-1082) ཁ་སྐོང་འབད། དབྱེ་ཁག་ཚུ་ ༣༧°C ལུ་སྐར་མ་ ༩༠ གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་དགོ། བརྟག་དཔྱད་འདི་མཇུག་བསྡུ་བའི་སྐབས་ལུ་ དབྱེ་ཁག་ཚུ་ ཆུ་གི་ཐབས་ཤེས་ ༼pH ༧.༤༽ ནང་ལུ་ ༧༥ mM ammonium carbonate ཡོད་མི་འདི་གིས་ མགྱོགས་པ་རང་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ ༤༠:༤༠:༢༠ ༼v:v:v༽ acetonitrile (ACN): methanol: water ནང་ལུ་ གཅིག་མཚུངས་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། དབྱེ་ཁག་ཚུ་ འཁྱེག་གུ་སྐར་མ་༣༠གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་པའི་ཤུལ་ལས་ དཔེ་ཚད་ཚུ་ དྲོད་ཚད་༤གི་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༠གི་རིང་ལུ་ ཇི་༢༡༠༠༠ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་ཞིནམ་ལས་ དྭངས་གསལ་གྱི་ཆུ་འདི་ SpeedVac concentratorནང་ལུ་ སྐམ་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། གྲུབ་འབྲས་སྐམ་པའི་རྫས་སྦྱོར་གྱི་ཕྲ་ཕུང་འདི་ དབྱེ་དཔྱད་མ་འབད་ཚུན་ཚོད་ -༨༠°C ལུ་ གསོག་འཇོག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
ཁུ་བ་གི་ཚོས་གཞི་བརྟག་དཔྱད་ ༡༣ C-labeled amino acids གི་དབྱེ་དཔྱད། ཁུ་བ་གི་ཚོས་གཞི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ༼LC-MS༽ དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཕྲ་ཕུང་འདི་ LC-MS གི་ཆུ་གི་ནང་ལུ་ ༧༥μl ལོག་སྟེ་རང་ བཀག་བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། ༼Honeywell༽ དྲོད་ཚད་༤ལུ་ སྐར་མ་༥གི་རིང་ལུ་ ༢༡༠༠༠ g ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ amino acid flux དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ གསལ་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཡོད་པའི་ ཆུ་གི་ཆུ་འདི་ ༢༠ μl ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་དང་ གཞན་མི་ཐོན་ཁུངས་འདི་ དེ་འཕྲོ་ལས་ anion དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ༼འོག་ལུ་བལྟ་༽ Amino acid དབྱེ་དཔྱད་འདི་ ཧེ་མ་ལས་ འགྲེལ་བཤད་རྐྱབ་ཡོད་མི་ benzoyl chloride derivatization protocol (55, 56) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། གོམ་པ་འགོ་དང་པ་ནང་ ༡༠༠ mM སོ་དྲི་ཡམ་ཀར་བོ་ནེཊ་ (Sigma-Aldrich) ༡༠ μl དེ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ ཐོན་ཁུངས་ ༢༠ μl ནང་ བླུགས་ཞིནམ་ལས་ LC རིམ་པ་ ACN ལུ་ ༢% བེན་ཛོ་ཡལ་ཁོ་ལོ་རཱའིཌ་ (Sigma-Aldrich) ༡༠ μl བླུགས་ཡོདཔ་ཨིན་པས། དཔེ་ཚད་འདི་ དུས་ཡུན་ཐུང་ཀུ་ཅིག་གི་རིང་ལུ་ བསྒྱིར་ཞིནམ་ལས་ དྲོད་ཚད་༢༠ལུ་ སྐར་མ་༥གི་རིང་ལུ་ ཇི་༢༡༠༠༠ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། གཙང་མ་བཟོ་ཡོད་པའི་ ཆུ་འདི་ ཀོང་རྩེ་ཤེལ་གྱི་བཙུགས་ཏེ་ ༢ ml གི་ autosampler vial ནང་ལུ་སྤོ་བཤུད་འབད། ༼200 μl འབོར་ཚད་༽ དཔེ་ཚད་ཚུ་ ཀིའུ་ཨེག་ཨེག་སི་ཊིབ་ (ཀིའུ་ཨི)-ཨེཆ་ཨེཕ་ ༼མཐོ་དྲགས་ས་ཁོངས་ཨོར་བི་ཊརཔ་༽ མཐོ་དྲགས་ཅན་གྱི་ གཏན་གཏན་གྱི་ འོད་རླབས་ཚད་འཇལ་ཆས་ ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག༽ དང་ཅིག་ཁར་ མཐུད་དེ་ཡོད་མི་ ཨེ་ཀུ་ཝི་ཊི་ཨའི་ཀ་ལཱསི་ ལཱ་ཤུགས་ཆེ་བའི་ ཨེལ་སི་ལམ་ལུགས་ ༼ཆུ་༽ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ 2 μl གི་ འབྱུང་ཁུངས་དཔེ་ཚད་འདི་ 100×1.0 mm མཐོ་བའི་ སི་ལི་ཀ་ T3 ཀ་ཆེན་ (Waters) ནང་ 1.8μm རྡུལ་ཕྲན་ཡོད་པའི་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ཆུ་རྒྱུན་གྱི་ཚད་གཞི་འདི་ ༡༠༠μl/min ཨིནམ་དང་ བཱ་ཕར་ལམ་ལུགས་ནང་ བཱ་ཕར་ཨེ་ (༡༠ mM ammonium formate དང་ ༠.༡༥% ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་ཆུ་ནང་) དང་ བཱ་ཕར་བི་ (ACN) ཚུ་ཡོདཔ་ཨིན། གྱེན་ཐིག་འདི་གཤམ་གསལ་ལྟར་ཨིན་: སྐར་མ་ ༠ ལུ་ ༠%B; ༠%ཁ། ༠ ལས་ ༡༥% བི་སྐར་མ་ ༠ ལས་ ༠.༡ ལུ། སྐར་མ་ ༠.༡ ནས་ ༠.༥ བར་ ༡༥ ནས་ ༡༧% བི་དང་། B སྐར་མ་ ༠.༥ ནས་ ༡༤ བར་ ༡༧ ནས་ ༥༥% ལུ། B སྐར་མ་ ༡༤ ནས་ ༡༤.༥ བར་ ༥༥ ནས་ ༧༠% ལུ། སྐར་མ་ ༡༨ ལུ་ ༡༤.༥ ལས་ ༧༠ ལས་ ༡༠༠% བི། སྐར་མ་ ༡༨ ནས་ ༡༩ བར་ ༡༠༠% B དང་། སྐར་མ་ ༡༩ ལས་ ༡༩.༡ ལུ་ ༡༠༠ ལས་ ༠% B དང་། ༠% བི་ སྐར་མ་ ༡༩.༡ ནས་ ༢༨ བར་ (༥༥, ༥༦)། QE-HF mass spectrometer འདི་ m/z (mass/charge ratio) ༥༠ ལས་ ༧༥༠ གི་བར་ན་ཡོད་པའི་ གློག་རྡུལ་ཚད་འཇལ་ཐབས་ལམ་ནང་ ལཱ་འབདཝ་ཨིན། དྲོད་བཏགས་ཡོད་པའི་གློག་རྫས་གློག་བསྒྱུར་གྱི་འབྱུང་ཁུངས་འདི་ འཕྲུལ་ཆས་ཀྱི་གློག་ཤུགས་ ༣.༥ kV དང་ དྲོད་ཚད་༢༥༠°C དེ་ལས་ ཤེལ་གྱི་རླུང་རྒྱུན་ ༦༠ AU ༼གང་བྱུང་ཆ་ཚན་༽ དང་ ལྷན་ཐབས་ཀྱི་རླུང་རྒྱུན་ ༢༠ AU ལུ་ལཱ་འབདཝ་ཨིན། ༢༥༠°C ཡིན། S མཐོང་སྣང་འདི་ 60 AU ལུ་གཞི་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
13C རྟགས་བཀོད་ཡོད་པའི་རང་བཞིན་སྐྱུར་རྫས་ཀྱི་ Anion chromatography-MS དབྱེ་དཔྱད། ལྷག་ལུས་རྫས་སྦྱོར་གྱི་ཆརཔ་ (༥༥μl) འདི་ ཌའི་ཨོ་ནེགསི་གློག་རྡུལ་ཚོས་གཞི་རིམ་ལུགས་ (ICS ༥༠༠༠+, ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། མདོར་བསྡུས་ན་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཐོན་ཁུངས་ ༥μl འདི་ HPLC (༢ mm×༢༥༠ mm, རྡུལ་ཕྲན་གྱི་ཚད་ ༤μm, Thermo Fisher Scientific) དང་ཅིག་ཁར་ Dionex IonPac AS11-HC ཀ་ཆེན་ནང་ལུ་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ཌིའོ་ནེགསི་ཨའོན་པེག་ཨེ་ཇི་༡༡-ཨེཆ་སི་སྲུང་སྐྱོབ་ཀ་ཆེན་ (༢ ཨེམ་ཨེམ་ x ༥༠ ཨེམ་ཨེམ་, ༤μm, ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག)། ཀེར་ཐིག་དྲོད་ཚད་འདི་ ༣༠°C ལུ་བཞག་ཡོདཔ་དང་ རང་བཞིན་དཔེ་ཚད་འདི་ ༦°C ལུ་གཞི་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཆུ་བཏོན་མི་བརྒྱུད་དེ་ འབྲུ་རྫས་ཧའི་ཌོ་ཨོག་སའིཌ་གི་གཤམ་ཐིག་འདི་ བཏོན་ནིའི་དོན་ལུ་ ཆུ་བཏོན་མི་ པོ་ཊ་སི་ཡམ་ཧའི་ཌོ་ཨོག་སའིཌ་གི་ཐུམ་སྒྲིལ་འདི་ལག་ལེན་འཐབ། 380μl/min གི་རྒྱུག་ཚད་ནང་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ གཤམ་གསལ་གྱི་ གྱེན་ཐིག་ཚུ་ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ སྐར་མ་ ༠ ལས་ ༣ ཚུན་ ༡༠ mM KOH དང་། སྐར་མ་ ༣ ནས་ ༡༢ བར་ ༡༠ ནས་ ༥༠ mM KOH དང་། སྐར་མ་ ༡༢ ནས་ ༡༩ བར་ ༥༠ ནས་ ༡༠༠ mM KOH དང་། སྐར་མ་ ༡༩ ནས་ ༢༡ བར་ , ༡༠༠ mM KOH; སྐར་མ་ ༢༡ ནས་ ༢༡.༥ བར་ ༡༠༠ ནས་ ༡༠ mM KOH བར། ཀ་ཆེན་འདི་ སྐར་མ་༨.༥ གི་རིང་ལུ་ ༡༠ mM KOH གི་འོག་ལུ་ ལོག་སྟེ་འདྲ་མཉམ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན།
བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་ ཀ་ཆེན་གི་ཤུལ་ལས་ 150μl/min isopropanol ལྷན་ཐབས་ཀྱི་རྒྱུན་ལམ་དང་གཅིག་ཁར་ མཉམ་སྡེབ་འབད་དེ་ དེ་ལས་ གློག་བསྒྱུར་གྱི་ཐབས་ལམ་ནང་ལུ་ ལཱ་འབད་མི་ མཐོ་དྲགས་ཅན་གྱི་འོད་རླབས་ཚད་འཇལ་ཆས་ལུ་ བཀོད་ཁྱབ་འབདཝ་ཨིན། MS གིས་ m/z 50 ལས་ 750 ཚུན་ 60,000 གི་ཐག་གཅོད་དང་གཅིག་ཁར་ བུངས་ཚད་ཀྱི་ཁྱབ་ཚད་འདི་ ལྟ་རྟོག་འབད་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། AGC འདི་ ༡×༡༠༦ ལུ་གཞི་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་དང་ གློག་རྡུལ་དུས་ཚོད་མཐོ་ཤོས་འདི་ ༡༠༠ ཨེམ་ཨེསི་ལུ་བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། དྲོད་བཏང་བའི་ཨི་ཨེས་ཨའི་འབྱུང་ཁུངས་འདི་ ༣.༥ ཀེ་ཝི་གི་ ཆུ་སྤྲིན་གློག་ཤུགས་ནང་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། གློག་རྡུལ་འབྱུང་ཁུངས་ཀྱི་སྒྲིག་སྟངས་གཞན་ཚུ་གཤམ་གསལ་ལྟར་ཨིན། sheath རླངས་རྫས་རྒྱུན་འབབ།, 60 AU; ལྷན་ཐབས་རླངས་རྫས་རྒྱུན་འབབ་ 300°C ལུ་ 20 AU དང་ S lens 60 AU ལུ་གཞི་སྒྲིག་འབད་ནི།
13C རྟགས་བཀོད་པའི་བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད། མཉམ་རྫས་ཆ་ཚད་ཀྱི་གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཊེརེསི་ཕའི་ནར་མཉེན་ཆས་ (ཐོན་རིམ་༤.༢ ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག་) ལག་ལེན་འཐབ། རྫས་སྦྱོར་རེ་རེ་གི་ངོ་རྟགས་འདི་ བློ་གཏད་ཅན་གྱི་ཁུངས་གཏུག་རྫས་སྦྱོར་གྱིས་ བདེན་དཔྱད་འབད་དེ་ རང་དབང་ཅན་སྦེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། isotope enrichment དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ 13C isotope (Mn) རེ་རེའི་ བཏོན་པའི་ ion chromatogram (XIC) གི་ས་ཁོངས་འདི་ [M + H] + ལས་བཏོན་ཡོདཔ་ད་ དེ་ནང་ n འདི་ དམིགས་གཏད་རྫས་སྦྱོར་གྱི་ནག་རྫས་ཨང་གྲངས་ཨིནམ་ལས་ amino acids དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། XIC གི་ མང་ཚོགས་ཀྱི་ འཛོལ་བ་འདི་ ས་ཡ་རེ་ལུ་ ཆ་ཤས་ལྔ་ལས་ ཉུངམ་དང་ RT གི་ འཛོལ་བ་འདི་ སྐར་མ་ ༠.༠༥ ཨིན། མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ བརྟག་དཔྱད་འབད་མི་ isotopeརེ་རེ་གི་ཆ་ཚད་འདི་ འབྲེལ་ཡོད་རྫས་སྦྱོར་གྱི་ isotopesག་ར་གི་བསྡོམས་རྩིས་རྐྱབ་སྟེ་ འབད་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། འ་ནི་ཆ་ཚད་ཚུ་ isotope རེ་རེ་གི་དོན་ལུ་ བརྒྱ་ཆའི་གནས་གོང་སྦེ་བྱིན་དོ་ཡོདཔ་ད་ གྲུབ་འབྲས་འདི་ ཧེ་མ་བཀོད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ molar% enrichment (MPE) སྦེ་བཀོད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། (༤༢)
གྱང་ཤུགས་ཅན་གྱི་རྩ་ཕྲན་འདི་ འཁྱེག་གི་ནང་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་༨༠གི་མི་ཐ་ནོལ་ནང་ལུ་ གཅིག་མཚུངས་སྦེ་བཟོ་སྟེ་ སྐར་མ་༣༠གི་རིང་ལུ་ -༢༠གི་ནང་ལུ་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་འདི་ལོག་སྟེ་བསྒྱིར་ཞིནམ་ལས་ +༤°C ལུ་སྐར་མ་༣༠གི་རིང་ལུ་བསྒྱིར་དགོ། དཔེ་ཚད་འདི་ དྲོད་ཚད་༤ལུ་ སྐར་མ་༥གི་རིང་ལུ་ ཇི་༢༡༠༠༠ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་ཞིནམ་ལས་ གྲུབ་འབྲས་འདི་ བསྡུ་གསོག་འབད་དེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ དྲོད་ཚད་༢༥ལུ་ SpeedVac བསྡུ་སྒྲིག་འབད་མི་འདི་ལག་ལེན་འཐབ་ཏེ་ སྐམ་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། གོང་ལས་བཤད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ LC-MS དབྱེ་དཔྱད་འདི་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་པའི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ amino acids གུ་ལུ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། TraceFinder ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ༼ཐོན་རིམ་༤.༢, Thermo Fisher Scientific༽ གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ རྫས་སྦྱོར་རེ་རེ་གི་ monoisotopic mass ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་སྡུད་ཀྱི་ ཚད་གཞི་སྤྱིར་བཏང་བཟོ་ནི་འདི་ preprocessCore མཉེན་ཆས་ཐུམ་སྒྲིལ་ (༥༧) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
Slice གྲ་སྒྲིག། བྱི་ཙི་འདི་ ནག་རླུང་གིས་ མགྱོགས་པ་རང་ སྨན་བཅོས་འབད་དེ་ མགུ་ཏོ་བཏོག་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ཀླདཔ་འདི་ མགུ་ཏོ་ལས་ མགྱོགས་པ་རང་ བཏོན་བཏང་ཞིནམ་ལས་ འཁྱེག་གིས་བཀང་མི་ དཀྲོག་གཏམ་གྱི་གྲི་ ༼HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany༽ འདི་ 300 ལས་ 375 μm carbon sections O9 sa5d དང་ 300 ལས་ 375 μm gas2d ལུ་བཏོག་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། CO2) དམའ་བའི་ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM སོ་དྲི་ཡམ་ཕོསི་ཕེཊ་བཱ་ཕར་, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 དང་ 6.0 mM MgCl37 དང་ 6.0 mM MgCl02 ལུ། mOsm). ཐོབ་པའི་ཀླད་པའི་ཆ་ཤས་ཚུ་ Ca2 + ACSF མཐོ་དྲགས་ཡོད་པའི་ཁང་མིག་ཅིག་ནང་ སྤོ་བཤུད་འབད། དང་ ༣༡༠ ནས་ ༣༢༠ mOsm བར། བཤུད་ཕྲ་ཚུ་ སྐར་མ་༢༠ ལས་༣༠ གི་རིང་ལུ་ གསོག་འཇོག་འབད་དེ་ སྒྲ་བཟུང་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ ལོག་བཙུགས་ཚུགས།
སྒྲ་བཟུང་འབད་ནི། ཐོ་བཀོད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ གཏན་འཇགས་སྒྲ་བཟུང་ཁང་མིག་དང་ ཆུ་ནང་ལུ་བཙུགས་མི་ དམིགས་གཏད་ཀྱི་མིག་ཤེལ་ ༢༠x ༼ཚན་རིག་༽ ཡོད་པའི་ ཕྲ་མཐོང་ཆེ་ཤེལ་གྱི་ འཁྲབ་སྟེགས་འདི་ སྒྲ་བཟུང་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། Purkinjeགི་ཁམས་ཕྲན་འདི་ (i) གཟུགས་ཀྱི་སྦོམ་ཆུང་དང་ (ii) ཀླདཔ་གི་གནས་ས་ དེ་ལས་ (iii) འོད་མདངས་ཅན་གྱི་mtYFPསྙན་ཞུ་འབད་མི་རིགས་མཚན་གྱི་བརྡ་སྟོན་ཚུ་གིས་ ངོས་འཛིན་འབད་ནུག མེ་གོ་ཧམ་༥ལས་༡༡གི་བར་ན་འབད་མི་ ཐིག་ལེ་འདི་ བོ་རོ་སི་ལི་ཀེཊ་ཤེལ་གྱི་ ཆུ་རྒྱུན་ཅིག་གིས་ འཐེན་བཏངམ་ཨིན། སྒྲ་བཟུང་ཚུ་ག་ར་ ELC-03XS npi patch clamp amplifier གིས་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། བརྟག་དཔྱད་འདི་ དཔེ་ཚད་ཀྱི་ཚད་གཞི་ ༡༢.༥ ཀེ་ཨེཆ་ཛི་ནང་ ཐོ་བཀོད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། བརྡ་མཚོན་འདི་ ༡.༣ དང་ ༡༠ ཀེ་ཨེཆ་ཛི་གི་ བཏོག་བཏང་བསྐྱར་འབྱུང་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ཐུང་ཐུང་བེསི་སེལ་ཚགས་མ་གཉིས་དང་གཅིག་ཁར་ ཚགས་མ་བཏངམ་ཨིན། གདོང་ཁེབས་དང་ ཆུ་བླུགས་ཆས་ཀྱི་ ཤོང་ཚད་འདི་ སྐད་སྦོམ་བཟོ་མི་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ རྒུད་འཐུས་གློག་ལམ་གྱིས་ རྒུད་འཐུས་སྤྲོདཔ་ཨིན། བརྟག་དཔྱད་ཚུ་ག་ར་ ཨོར་ཀ་ཕེལེཤ་༤.༠ པར་ཆས་ ༼ཧ་མ་མཱ་ཙུ་ གཱར་དྲེན་ ཇར་མ་ནི་༽ གི་ཚད་འཛིན་འོག་ལུ་ འབད་ཡོདཔ་དང་ འདི་ཡང་ ཧོ་ཀ་ཝོ་མཉེན་ཆས་ ༼ཐོན་རིམ་༢.༨ ཧ་མ་མ་ཙུ་ གཱར་དྲེན་ ཇར་མ་ནི་༽ གིས་ ཚད་འཛིན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
དུས་རྒྱུན་གྱི་ནང་ཐིག་ཆ་ཚང་རིམ་སྒྲིག་དང་དབྱེ་དཔྱད། དེ་འཕྲོ་ལས་ ཐོ་བཀོད་འབད་བའི་ཧེ་མ་ གཤམ་གསལ་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་ཡོད་པའི་ ནང་འཁོད་ཀྱི་ཐབས་ཤེས་འདི་ པི་པེཊ་ནང་བཀང་དགོ། (Na) དང་ ༡༠.༠ mM ཀིརི་ཊི་ནིན་ཕོསི་ཕེཊ་ pH ༧.༢༥ ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་ཡོདཔ་ད་ ཨོ་སི་མོ་ཊིག་གནོན་ཤུགས་འདི་ ༢༩༠ mOsm (sucrose) ལུ་ལྷོད་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་འཕྲོ་ལས་ 0 pA གི་ཤུགས་བཏང་ཞིནམ་ལས་ གྱིབ་མ་འདི་ བརྡལ་བཤིག་གཏང་བའི་ཤུལ་ལས་ ངལ་གསོ་འབད་བའི་ གྱིབ་མ་གི་འོས་འབབ་འདི་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། ཨིན་པུཊི་གདོང་ལེན་འདི་ -༤༠ དང་ -༣༠ དེ་ལས་ -༢༠ དང་ -༡༠ པི་ཨེ་གི་ ཧའི་པར་པོ་ལར་ཟིཌ་གློག་རྒྱུན་ཚུ་ འཇུག་སྤྱོད་འབད་དེ་ འཇལཝ་ཨིན། གློག་ཤུགས་ལན་འདེབས་ཀྱི་ཚད་གཞི་འཇལ་ཞིནམ་ལས་ ཨིན་པུཊི་གདོང་ལེན་རྩིས་སྟོན་འབད་ནི་ལུ་ ཨོམ་གྱི་ཁྲིམས་ལུགས་ལག་ལེན་འཐབ། རང་བཞིན་གྱི་ལས་སྣ་འདི་ སྐར་མ་༥ གི་རིང་ལུ་ གློག་ཤུགས་བཀག་ཆ་ནང་ ཐོ་བཀོད་འབད་ཡོདཔ་ད་ sPSC འདི་ Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ནང་ལུ་ ཕྱེད་ཀ་རང་བཞིན་ངོས་འཛིན་ཡིག་ཆ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། IV གུག་ཀྱོག་དང་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་གནས་སྟངས་ཀྱི་གློག་རྒྱུན་འདི་ འཕྲུལ་ལྟོ་འདི་ འོས་འབབ་སོ་སོ་ནང་ བསྡམ་བཞག་སྟེ་ འཇལཝ་ཨིན། AP གི་ཐོན་སྐྱེད་འདི་ depolarizing current ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། -70 mV ལུ་ ཁམས་ཕྲན་འདི་ ཌི་པོ་ལ་རི་ཟིང་ ད་ལྟོའི་ འཕར་རྩ་འཇུག་སྤྱོད་འབད་བའི་སྐབས་ བསྡམ་བཞག། སྒྲ་བཟུང་ཆ་ཤས་རེ་རེ་གི་གོམ་པ་ཚད་འདི་སོ་སོ་སྦེ་བདེ་སྒྲིག་འབད།(༡༠ ལས་ ༦༠ པི་ཨེ་)། ཨེ་པི་བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་ཤོས་འབྱུང་བཅུག་མི་ པཱལསི་སི་པིག་ཚུ་ལག་ཐོག་ལས་རྩིས་རྐྱབ་སྟེ་ ཨེ་པི་བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་ཤོས་རྩིས་སྟོན། AP གི་ཚད་གཞི་འདི་ འགོ་དང་པ་ APs གཅིག་དང་ ཡང་ན་ མངམ་འབྱུང་བཅུག་མི་ depolarization pulse གི་ འབྱུང་ཁུངས་གཉིས་པ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབདཝ་ཨིན།
དོང་ཅན་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་རིམ་སྒྲིག་དང་དབྱེ་དཔྱད། ཚད་ལྡན་མཐུན་འབྲེལ་ཚུ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དོང་ཅན་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་སྒྲ་བཟུང་འབད། གཤམ་གསལ་གྱི་ཆ་ཤས་ཚུ་མེད་པའི་ ATP- དང་ GTP- མེད་པའི་ ཆུ་བླུགས་ཆས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ pH 7.2 ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དགོ། (KOH ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་) ATPདང་GTPའདི་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ ཚད་འཛིན་མ་འབད་བའི་ ཆུ་འཛུལ་ནི་ལས་ བཀག་ཐབས་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ ཐབས་ཤེས་ནང་ལས་ བཏོན་བཏང་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། ཐིག་ལེ་འདི་ ནང་འཁོད་ཀྱི་ཐབས་ཤེས་ amphotericin ཡོད་པའི་ ༼ཧ་ལམ་ ༢༠༠ ལས་ ༢༥༠ μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich༽ གིས་ བསྒང་སྟེ་ ཐིག་ལེ་བཏོན་ཡོད་པའི་ཐོ་བཀོད་ཐོབ་ཚུགས། Amphotericin འདི་ dimethyl sulfoxide ནང་ལུ་བཞུ་ཡོདཔ་ཨིན། ལག་ལེན་འཐབ་མི་ DMSO གི་ཆ་ཚད་འདི་གིས་ ཞིབ་འཇུག་འབད་མི་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ལུ་ གལ་གནད་ཅན་གྱི་གནོད་པ་མེདཔ་ཨིན། བརྡུང་རྫོབ་འབད་བའི་སྐབས་ རྒྱུན་ལམ་གྱི་གདོང་ལེན་ (Ra) འདི་ འཕྲོ་མཐུད་དེ་རང་ བལྟ་རྟོག་འབད་དེ་ Ra དང་ AP གི་ འཕར་ཚད་བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་བའི་ཤུལ་ལས་ བརྟག་དཔྱད་འགོ་བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། (སྐར་མ་༢༠-༤༠) རང་བཞིན་གྱི་ལས་སྣ་འདི་ སྐར་མ་༢ ལས་༥ གི་རིང་ལུ་ གློག་ཤུགས་དང་/ཡང་ན་ ད་ལྟོའི་བཀག་ཆ་ནང་ འཇལཝ་ཨིན། གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ Igor Pro (ཐོན་རིམ་ ༧.༠༥.༢, WaveMetrics, USA) དང་ Excel (ཐོན་རིམ་ ༢༠༡༠, Microsoft Corporation, Redmond, USA) དེ་ལས་ GraphPad Prism (ཐོན་རིམ་༨.༡.༢, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ཚུ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཡུ་ནའི་ཊེཊ་ཨི་སི་ཊེཊ་)། རང་བཞིན་གྱི་ཨེ་པི་ཚུ་ངོས་འཛིན་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ཨི་གོར་པྲོ་གི་ ནིའུ་མེ་ཊིག་ v3.0c པ་ལག་ཨིན་འདི་ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། དྲན་ཐོ་རེ་རེ་གི་དོན་ལུ་ རང་སོའི་བདེ་སྒྲིག་འབད་མི་ བྱིན་ཡོད་པའི་ཚད་གཞི་ཅིག་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ཨེ་པི་ཚུ་ རང་བཞིན་གྱིས་ངོས་འཛིན་འབད། སྤྱང་ཀི་བར་མཚམས་ལག་ལེན་འཐབ་ཐོག་ལས་ འཕྲལ་མགྱོགས་སྤྱང་ཀི་བསྐྱར་འབྱུང་མཐོ་ཤོས་དང་ སྤྱིར་སྙོམས་སྤིཀ་བསྐྱར་འབྱུང་དང་གཅིག་ཁར་ སྤྱང་ཀི་བསྐྱར་འབྱུང་འདི་གཏན་འབེབས་བཟོ།
PN ཟུར་གནས་། ཧེ་མ་ལས་དཔར་བསྐྲུན་འབད་ཡོད་པའི་མཐུན་གྲོས་ལུ་ མཐུན་སྒྲིག་འབད་དེ་ PNs འདི་ བྱི་ཙི་གི་ཀླདཔ་ལས་ དམིགས་བསལ་གྱི་གནས་རིམ་ཅིག་ནང་ བཙག་འཐུ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (༥༨) མདོར་བསྡུས་ན་ ཀླདཔ་འདི་ འཁྱགས་རོམ་གྱི་ བརྡབ་གསིག་བརྒྱུད་ལམ་ནང་ བཤག་བཅོས་འབད་དེ་ [HBSS Ca2+ དང་ Mg2+ མེད་པར་ 20 mM glucose དང་ penicilin (50 U/ml) དེ་ལས་ streptomycin (0.05 mg, HB-ml) ཚུ་ ཁ་སྐོང་འབད་དེ་ དེ་ལས་ བརྒྱུད་ལམ་འདི་ mgHCpal1steine ​​དང་གཅིག་ཁར་ བཞུ་བཅུག་ནུག། / ml), པ་པེན་ (16 U / ml) དང་ ཌི་ཨོ་སི་རི་བོ་ནིའུ་ཀི་ལི་སི་ I (DNase I; 0.1 mg/ml)] དྲོད་ཚད་ ༣༠ °C ལ་སྐར་མ་ ༣༠ རིང་སྨན་བཅོས་བྱེད་དགོས། དང་པ་ར་ སྒོང་རྡོག་གི་མཆིནམ་ (༡༠ mg/ml) དང་ BSA (༡༠ mg/ml) དེ་ལས་ DNase (0.1 mg/ml) ཡོད་པའི་ HBSS བརྒྱུད་ལམ་ནང་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ བཞུ་ཁུ་བཀག་ཐབས་འབད་ཞིནམ་ལས་ དེ་ལས་ HBSS བརྒྱུད་ལམ་ནང་ 20 mM streecose ཡོད་པའི་ HBSS བརྒྱུད་ལམ་ནང་ དལ་བུས་སུ་ བརྡུངས་དགོ། (༠.༠༥ mg/ml) དང་ DNase (༠.༡ mg/ml) གཉིས་ཀྱིས་ཁམས་ཕྲན་གཅིག་བཏོན་ཡོད། དེ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ 70μm ཁམས་ཕྲན་ཚགས་ཆས་བརྒྱུད་དེ་ ཚགས་ཞིནམ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་གྱི་ཐོག་ལས་ བརྡུངས་ཞིནམ་ལས་ དབྱེ་ཁག་བརྒྱུད་ལམ་ནང་ ལོག་སྟེ་རང་ བཙུགས་ཏེ་ 20 mM glucose, 20% fetal bovine/petal Umylin ) Serum, (༠.༠༥ མི་ལི་གྷ་རམ་/མི་ལི་ལར་)]; ཁམས་ཕྲན་གྱི་འཚོ་ཐབས་འདི་ propidium iodide དང་ཅིག་ཁར་ བརྟག་དཔྱད་འབད་དེ་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་མཐུག་ཚད་འདི་ ༡×༡༠༦ ལས་ ༢×༡༠༦ ཁམས་ཕྲན་/ml ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དགོ། ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཀྲི་གི་ཧེ་མ་ བསྒུགས་བཞག་མི་འདི་ ༥༠ μm ཁམས་ཕྲན་ཚགས་ཆས་བརྒྱུད་དེ་ ཚགས་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན།
ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཊར། ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་འདི་ ༤°C ལུ་ FACSAria III འཕྲུལ་ཆས་ ༼BD Biosciences༽ དང་ FACSDiva མཉེན་ཆས་༼BD Biosciences, version 8.0.1༽ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་བཀག་ཆ་འདི་ 100 μm གི་མཆོད་རྟེན་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ 20 psi གི་གནོན་ཤུགས་འོག་ལུ་ ~2800 events/sec གི་ཚད་གཞི་ནང་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ཡོདཔ་ཨིན། རང་ལུགས་ཀྱི་ཚད་གཞི་(ཁམས་ཕྲན་གྱི་སྦོམ་ཆུང་དང་ ཉེ་རིང་ཕྱེ་ནི་ དེ་ལས་ ཁ་སྟོར་འགྱོ་བའི་ཁྱད་ཆོས)གིས་ PNའདི་ གཞན་མི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ལས་ སོ་སོ་སྦེ་བཞག་མི་ཚུགས་ནི་ཨིནམ་ལས་ ཐབས་བྱུས་འདི་ YFPགི་ཤུགས་ཚད་དང་ mitoYFP+དང་ MitoYFPཚད་འཛིན་གྱི་ནང་ལུ་ ཐད་ཀར་དུ་ག་བསྡུར་འབད་མི་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ཨིན་མས། YFP འདི་ དཔེ་ཚད་འདི་ ༤༨༨ nm གི་གློག་འོད་ཐིག་དང་གཅིག་ཁར་ འོད་འཕྲོ་བཏང་ཐོག་ལས་ སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་ད་ བརྡ་མཚོན་འདི་ ༥༣༠/༣༠ nm band pass filter ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བརྟག་དཔྱད་འབདཝ་ཨིན། mitoYFP+བྱི་ཙི་ནང་ལུ་ Rosa26-mitoYFPསྙན་ཞུ་འབད་མི་རིགས་མཚན་གྱི་ནུས་ཤུགས་འདི་ཡང་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་གཟུགས་དང་ axonགི་ཆ་ཤེས་ཚུ་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། 7-AAD འདི་ 561 nm སེརཔོ་གི་འོད་འཕྲོ་གིས་ སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་དེ་ ཁམས་ཕྲན་ཤི་མི་ཚུ་ ཕྱིར་འཐེན་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ 675/20 nm bandpass ཚགས་མ་གིས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། དུས་མཉམ་ལུ་ སྐར་མའི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ནི་གི་དོན་ལས་ ཁམས་ཕྲན་འཕྱེལ་འགྱོ་མི་འདི་ ACSA-2-APC གི་ཐོག་ལས་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཞིནམ་ལས་ དཔེ་ཚད་འདི་ ༦༤༠ཨེན་ཨེམ་གྱི་ ལེ་ཟར་ཐིག་གིས་ འོད་འཕྲོ་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ༦༦༠/༢༠ ཨེན་ཨེམ་གྱི་ བེནཌ་པཱསི་ཚགས་མ་འདི་ བརྡ་མཚོན་བརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན།
བསྡུ་སྒྲིག་འབད་མི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་གྱི་ཐོག་ལས་ ༼༡༡༡༠ rpm, སྐར་མ་༥, ༤°C༽ ལག་ལེན་མ་འཐབ་ཚུན་ཚོད་ -༨༠°C ལུ་ གསོག་འཇོག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། Mfn2cKO བྱི་ཙི་དང་ ཁོང་གི་བྱི་ཙི་ཚུ་ བྱ་རིམ་གྱི་འགྱུར་བ་མར་ཕབ་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཉིནམ་གཅིག་ནང་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། FACS གནས་སྡུད་གསལ་བཀོད་དང་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ FlowJo མཉེན་ཆས་ (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
གོང་ལས་བཤད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ (༥༩) དུས་ཚོད་ངོ་མའི་ PCR འདི་ mtDNA གི་འབོར་ཚད་བལྟ་ནི་གི་དོན་ལུ་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་པའི་ རྩ་ཁམས་ཕྲན་ལས་ DNA སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། རིམ་འགྲོས་དང་ ཚད་གཞི་ཚོར་ཤུགས་འདི་ འགོ་ཐོག་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་གྱངས་ཁ་སོ་སོ་ཚུ་གུར་ qPCR གཡོག་བཀོལ་ཐོག་ལས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། མདོར་བསྡུས་ན་ 50 mM tris-HCl (pH 8.5) དང་ 1 mM EDTA དེ་ལས་ 0.5% Tween 20 དང་ proteinase K (200 ng/ml) ཡོད་པའི་ lysis buffer ནང་ PN 300 བསྡུ་ལེན་འབད་དེ་ 55°C ལུ་ སྐར་མ་ 120 གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་དགོ། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ དྲོད་ཚད་༩༥གི་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༠གི་རིང་ལུ་ འཚོ་བཅུད་ཀེ་འདི་ ལཱ་འབད་མ་བཏུབ་སྦེ་བཞག་ནི་གི་དོན་ལས་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། mt-Nd1གི་དོན་ལས་ དམིགས་བསལ་གྱི་ TaqMan probe (Thermo Fisher) ལག་ལེན་འཐབ་ཏེ་ mtDNAའདི་ 7900HT Real-Time Fificsher SPCR system (Therificsher Scient) ནང་ལུ་ ཕྱེད་ཀ་གི་འབོར་ཚད་ PCR གི་ཐོག་ལས་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། མཚོན་རིག་ ཐོ་གཞུང་ཨང་ Mm04225274_s1 དང་ mt-Nd6 ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག་ ཐོ་གཞུང་ཨང་ AIVI3E8༽ དེ་ལས་ ༡༨S ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག་ ཐོ་གཞུང་ཨང་ Hs99999901_s1༽ རིགས་མཚན་ཚུ་ཨིན།
Proteome དཔེ་ཚད་གྲ་སྒྲིག། ཐབས་ཤེས་འདི་ སྐར་མ་༡༠གི་རིང་ལུ་ དྲོད་ཚད་༩༥ལུ་དྲོད་བཏང་ཞིནམ་ལས་ lysis bufferནང་ལུ་ སྒྲ་སྐད་བཏང་ཞིནམ་ལས་ [6 M guanidine chloride དང་ ༡༠ mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride དེ་ལས་ ༡༠ mM chloroacetamide དང་ ༡༠༠ mM tris-Lyse ཕོརན་ནའུ་རོན་ནང་ལུ་ བཙུགས་དགོཔ་ཨིན། སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ Bioruptor (Diagenode) གུ་ (སྐར་ཆ་༣༠ གི་འཕར་རྩ་ / སྐར་ཆ་༣༠ གི་བར་མཚམས་དུས་ཡུན་)། དཔེ་ཚད་འདི་ ༢༠ mM tris-HCl ༼pH ༨.༠༽ ནང་ལུ་ ༡:༡༠ གི་ཐོག་ལས་ བཞུ་བཅུག་སྟེ་ ༣༠༠ ng trypsin gold ༼Promega༽ དང་ཅིག་ཁར་ སླ་བསྲེ་རྐྱབ་སྟེ་ བཞུ་ཚད་ཆ་ཚང་གྲུབ་ཐབས་ལུ་ དྲོད་ཚད་༣༧°C ལུ་ མཚན་མོ་གཅིག་གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། ཉིནམ་གཉིས་པའི་ནང་ དཔེ་ཚད་འདི་ སྐར་མ་༢༠ གི་རིང་ལུ་ གྷ་རམ་༢༠༠༠༠ ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཆུ་ནང་ལུ་ཡོད་པའི་ཆུ་འདི་ བརྒྱ་ཆ་༠.༡གི་ ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་གི་ཐོག་ལས་ བཞུ་བཅུག་སྟེ་ ཐབས་ཤེས་འདི་ རང་གིས་བཟོ་མི་ StageTips གི་ཐོག་ལས་ ཚྭ་མེདཔ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་འདི་ SpeedVac ལག་ཆས་ནང་ལུ་ ༼Eppendorf concentrator plus 5305༽ དྲོད་ཚད་༤༥གི་ནང་ལུ་ སྐམ་བཏང་ཞིནམ་ལས་ དེ་ལས་ བརྒྱ་ཆ་༠.༡གི་ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་ནང་ལུ་ པེབ་ཀྲའིཌ་འདི་ བཀག་བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་ཆ་མཉམ་རང་ མི་གཅིག་གིས་ དུས་མཉམ་དུ་ བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན་པས། སྐར་མའི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་དཔེ་ཚད་ཚུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ཚྭ་མེད་པའི་པེབ་ཀྲའིགྲ་༤ μg འདི་ མཉམ་སྦྱོར་གྱི་ འབོར་ཚད་ཀྱི་རྟགས་བཀོད་ཡོདཔ་ཨིན། ༼ཀྲི་ཨེམ་ཀྲི་༡༠པེལེགསི་ ཐོ་གཞུང་ཨང་༩༠༡༡༠ ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག་༽ པེབ་ཀྲའིགྲ་ལས་ ཀྲི་ཨེམ་ཀྲི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ཆ་ཚད་༡:༢༠ གི་ཐོག་ལས་ ཁ་ཡིག་བཏགས་ཡོདཔ་ཨིན། TMT རྟགས་བཀོད་ནིའི་དོན་ལུ་ TMT རྫས་སྦྱོར་ 0.8 mg འདི་ ཆུ་མེད་པའི་ ACN 70 μl ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་རང་ བཀག་བཞག་སྟེ་ སྐམ་ཡོད་པའི་ peptide འདི་ 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) གི་ 9 μl ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་རང་ བཟོ་སྟེ་ ACN ནང་ལུ་ TMT རྫས་སྦྱོར་ 7 μl བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། གར་ཚད་བརྒྱ་ཆ་ ༤༣.༧༥ ཡིན། སྐར་མ་ ༦༠ གི་རིང་ལུ་ བརྡུངས་པའི་ཤུལ་ལས་ འགྱུར་ལྡོག་འདི་ ༥% གི་ hydroxylamine ༢ μl གིས་ བསད་ཡོདཔ་ཨིན། ཁ་ཡིག་བཏགས་ཡོད་པའི་ peptides ཚུ་བསྡུ་བསྒྱོམ་འབད་དེ་ སྐམ་བཏང་ཞིནམ་ལས་ 0.1% formic acid (FA) གི་ 200μl ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་བཙུགས་ཏེ་ གཉིས་ལུ་དབྱེ་སྟེ་ རང་གིས་བཟོ་མི་ StageTips ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ཚྭ་མེདཔ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ཕྱེད་ཀ་གཉིས་ཀྱི་གྲལ་ལས་གཅིག་འདི་ 1mm x 150mm Acquity chromatographic ཀ་ཆེན་ 130Å1.7μm C18 རྡུལ་ཕྲན་ཚུ་གིས་ བསྒང་ཡོདཔ་ཨིན། ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག)། 30μl/min གི་བཞུར་ཚད་ནང་ peptides སོ་སོ་སྦེ་ 1% ལས་ 50% བཱ་ཕར་ B སྐར་མ་ 85 གི་རིང་ལུ་ སྐར་མ་ 96 གི་རིམ་པ་གཅིག་ཁར་ སྐར་མ་ 50% ལས་ 95% བཱ་ཕར་ B སྐར་མ་ 3 གི་རིང་ལུ་ སོ་སོ་སྦེ་བཞག་སྟེ་ དེ་ལས་ 95 % བཱ་ཕར་ B གི་དོན་ལུ་ སྐར་མ་ 8 སོ་སོ་སྦེ་བཞག་དགོ། བཱ་ཕར་ཀ་འདི་ ༥% ACN དང་ ༡༠ mM ཨེམ་མོ་ནིཡམ་བཱའི་ཀར་བོ་ནེཊ་ (ABC) དང་ བཱ་ཕར་B འདི་ ༨༠% ACN དང་ ༡༠ mM ABC ཨིན། སྐར་མ་ ༣ རེ་ལུ་ དཔྱ་རྩིས་བསྡུ་ཞིནམ་ལས་ སྡེ་ཚན་གཉིས་ལུ་བསྡོམས་ཏེ་ (༡ + ༡༧ དང་ ༢ + ༡༨ ལ་སོགས་པ་ཚུ་) གནམ་སྟོང་ལྟེ་བའི་འཕྲུལ་ཆས་ནང་ སྐམ་བཏང་དགོ།
LC-MS/MS དབྱེ་ཞིབ། འོད་རླབས་ཚད་འཇལ་གྱི་དོན་ལུ་ པེཔ་ཊའིཌ་ (ཨང་ r119.aq) འདི་ 25 cm དང་ 75 μm ནང་ནའི་དབྱིབས་ PicoFrit དབྱེ་དཔྱད་ཀ་ཆེན་ ༼དམིགས་ཡུལ་གསརཔ་གི་མིག་ཤེལ་ ཆ་ཤས་ཨང་ PF7508250༽ ༡.༩ μm ReproSil-Pur C.Cr1, 120) དང་ཅིག་ཁར་ ཁ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། EASY-nLC 1200 (ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག་པ་ ཇར་མ་ནི་)། ཀ་ཆེན་འདི་ ༥༠°C ལུ་བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། བཱ་ཕར་ཀ་དང་བི་འདི་ཆུ་ནང་ལུ་ ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་བརྒྱ་ཆ་༠.༡ དང་ ཨེ་སི་ཨེན་བརྒྱ་ཆ་༨༠ ནང་ལུ་ ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་བརྒྱ་ཆ་༠.༡ ཨིན། Peptides ཚུ་ སྐར་མ་༦༥ གི་རིང་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་༦ ལས་༣༡ ཚུན་ བཱ་ཕར་བི་དང་ སྐར་མ་༥ གི་རིང་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་༣༡ ལས་༥༠ ཚུན་ བཱ་ཕར་བི་གི་རིམ་པ་ ༢༠༠ nl/min གི་ཐོག་ལས་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། བཏོན་བཏང་མི་ པེབ་ཀྲའིགྲ་ཚུ་ ཨོར་བི་ཀྲེཔ་ཕུའུ་ཤཱན་མཱསི་ཨིསི་པེག་ཀྲོ་མི་ཀྲར་ ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག༽ གི་ཐོག་ལུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། Peptide precursor m/z འཇལ་ཚད་འདི་ ༣༥༠ ལས་ ༡༥༠༠ m/z གི་ཁྱབ་ཚད་ནང་ ༡༢༠༠༠༠ གི་ཐག་གཅོད་དང་གཅིག་ཁར་ འབདཝ་ཨིན། ༢༧% སྤྱིར་བཏང་ཁ་ཐུག་རྐྱབ་པའི་ནུས་ཤུགས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ནུས་ཤུགས་མཐོ་བའི་ C trap dissociation (HCD) cleavage གི་དོན་ལུ་ གློག་ཤུགས་གནས་སྟངས་ ༢ ལས་ ༦ གི་བར་ན་ཡོད་པའི་ སྔོན་བརྡ་ཤུགས་ཆེ་ཤོས་འདི་ གདམ་ཁ་རྐྱབ་ཡོདཔ་ཨིན། འཁོར་རིམ་དུས་ཚོད་འདི་ ༡ s ལུ་གཞི་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། m/z གནས་གོང་འདི་ AGC དམིགས་ཚད་ཆུང་ཤོས་ ༥×༡༠༤ དང་ སྨན་ཁབ་བཙུགས་པའི་དུས་ཚོད་མཐོ་ཤོས་ ༨༦ ms ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ion trap ནང་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། ཆ་ཤས་བགོ་བཤའ་རྐྱབ་པའི་ཤུལ་ལས་ སྔོན་བརྡ་འདི་ ༤༥ s གི་དོན་ལུ་ ཌའི་ནམ་གྱི་ཕྱིར་བཏོན་ཐོ་ཡིག་ནང་བཙུགས་ཡོདཔ་ཨིན། TMTགི་རྟགས་བཀོད་མི་ peptidesའདི་ སེན་ཀྲི་མི་ཀྲར་༥༠དང་ སེན་ཀྲི་མི་ཀྲར་༧༥གི་ནང་ལུ་ ཁ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོདཔ་ད་ ༼Thermo Fisher Scientific ཐོ་གཞུང་ཨང་༡༦༤༩༤༢༽ (FAIMS) ཅ་ཆས་ (Thermo Fisher Scientific) འདི་ −50 དང་ −70 V གི་ རྒུད་འཐུས་གློག་ཤུགས་གཉིས་ལུ་ལཱ་འབདཝ་ཨིན། བརྒྱ་ཆ་ ༩༠ གི་ linear gradient elution ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ EASY-nLC 1200 ཐོག་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་ ༦ ལས་ ༣༡ གི་བར་ན་ བཱ་ཕར་གྱི་ཆ་ཚད་ཡོདཔ་ཨིན། བཱ་ཕར་ཀ་འདི་ ༠.༡% FA དང་ བཱ་ཕར་བི་འདི་ ༠.༡% FA དང་ ༨༠% ACN ཨིན། དབྱེ་དཔྱད་ཀ་ཆེན་འདི་ ༥༠°C ལུ་བཀོལ་སྤྱོད་འབདཝ་ཨིན། ཕེཨའི་ཨེམ་ཨེསི་ རྒུད་འཐུས་གློག་ཤུགས་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ ཡིག་སྣོད་ངོ་མ་འདི་ བགོ་བཤའ་རྐྱབ་ནི་ལུ་ ཕིརི་སི་ཊཱལ་ (ཐོན་རིམ་༡.༦, ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག་) ལག་ལེན་འཐབ།
ཟས་བཅུད་ངོས་འཛིན་དང་ཚད་གཞི། མཉམ་བསྡོམས་ཨེན་ཌོ་མེ་ཌ་འཚོལ་ཞིབ་འཕྲུལ་ཆས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ གནས་སྡུད་ངོ་མ་འདི་ མེགསི་ཀྭན་ཊི་ཐོན་རིམ་ ༡.༥.༢.༨ (https://maxquant.org/) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། Aequorea victoriaལས་ཐོབ་མི་ Cre recombinaseདང་YFPགོ་རིམ་གྱི་ཁ་སྐོང་ལུ་ peptideཆ་ཤས་ཀྱི་འོད་རླབས་འདི་ བྱི་ཙི་གི་རིམ་པ་དང་ isoformགོ་རིམ་གྱི་དོན་ལུ་ འཚོལ་ཞིབ་འབད་ནུག Methionine oxidation དང་ ཟས་བཅུད་ N-terminal acetylation འདི་ འགྱུར་ལྡོག་ཅན་གྱི་བཟོ་བཅོས་སྦེ་ གཞི་བཙུགས་འབད་ནུག སི་སི་ཊིན་ཀར་བ་མོ་ཡལ་མི་ཐའི་ལེ་ཤཱན་འདི་ བཟོ་བཅོས་གཏན་གཏན་སྦེ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། ཟས་བཅུད་ཚད་གཞི་ཚུ་ “དམིགས་བསལ་” དང་ “trypsin/P” ལུ་གཞི་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཟས་བཅུད་ངོས་འཛིན་གྱི་དོན་ལུ་ལག་ལེན་འཐབ་མི་ པེབ་ཊའིཌ་དང་ རེ་ཛར་པེབ་ཊའིཌ་གི་གྱངས་ཁ་ཉུང་ཤོས་འདི་ ༡ ཨིན། གཞན་དང་མ་འདྲ་བའི་ peptides གི་གྱངས་ཁ་ཉུང་ཤོས་འདི་ ༠ ཨིན། peptide སབ་ཁྲ་མཐུན་པའི་གནས་སྟངས་ནང་ལུ་ ཟས་བཅུད་ངོས་འཛིན་གྱི་ཚད་གཞི་འདི་ ༠.༠༡ ཨིན། “Second Peptide” གདམ་ཁ་འདི་ལྕོགས་ཅན་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། ཡིག་སྣོད་ངོ་མ་སོ་སོ་ཚུ་གི་བར་ན་ མཐར་འཁྱོལ་ཅན་གྱི་ངོས་འཛིན་ཚུ་སྤོ་བཤུད་འབད་ནི་ལུ་ “match entre runs” གདམ་ཁ་འདི་ལག་ལེན་འཐབ། ཁ་ཡིག་མེད་པའི་འབོར་ཚད་ (LFQ) (60) གི་དོན་ལུ་ LFQ ཉུང་མཐའ་ཆ་ཚད་གྱངས་ཁ་ ༡ ལག་ལེན་འཐབ། LFQགི་ཤུགས་ཚད་འདི་ དུས་ཚོད་རེ་ལུ་ རིགས་མཚན་སྡེ་ཚན་གཅིག་གི་ནང་ལུ་ གནས་གོང་གཉིས་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཚགས་མ་བཙུགས་ཏེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ རྒྱ་ཚད་ཀྱི་ཐོག་ལས་ སྤྱིར་བཏང་བཀྲམ་སྤེལ་ལས་ བཏོན་བཏངམ་ཨིན་མས། ༠.༣ དང་ ༡.༨ མར་སྤོ་བཤུད་འབད། ཨེལ་ཨེཕ་ཀིའུ་གྲུབ་འབྲས་དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་ལུ་ པར་སི་ཡསི་གློག་རིག་སྟེགས་བུ་ (https://maxquant.net/perseus/) དང་ ཨར་ (https://r-project.org/) ལག་ལེན་འཐབ། ཁྱད་པར་ཅན་གྱི་བརྡ་སྟོན་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ལི་མ་མཉེན་ཆས་ཐུམ་སྒྲིལ་ལས་ ཕྱོགས་གཉིས་ཀྱི་བར་མཚམས་ t བརྟག་དཔྱད་འདི་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། (༦༡) འཚོལ་ཞིབ་གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ ggplot དང་ FactoMineR དེ་ལས་ factoextra དང་ GGally དེ་ལས་ pheatmap ཚུ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབདཝ་ཨིན། TMT ལུ་གཞི་བཞག་པའི་ proteomics གི་གནས་སྡུད་འདི་ MaxQuant ཐོན་རིམ་ ༡.༦.༡༠.༤༣ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། སྤྱི་ལོ་༢༠༡༨ སྤྱི་ཟླ་༩ པའི་ནང་ ཕབ་ལེན་འབད་མི་ ཡུ་ནི་པྲོཊ་གི་ མི་གི་ཟས་བཅུད་གནས་སྡུད་གཞི་རྟེན་ནང་ལས་ ཟས་བཅུད་གནས་སྡུད་སྔོ་མ་འཚོལ་ཞིབ་འབད་ནི། ཁྱད་པར་ཅན་གྱི་བརྡ་སྟོན་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ R ནང་ལུ་ limma ལག་ལེན་འཐབ། གནས་སྡུད་ངོ་མ་དང་ གནས་སྡུད་གཞི་རྟེན་འཚོལ་ཞིབ་གྲུབ་འབྲས་ དེ་ལས་ གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་ལཱ་གི་རྒྱུན་རིམ་དང་ གྲུབ་འབྲས་ཚུ་ག་ར་ གནས་སྡུད་ཆ་ཚན་ངོས་འཛིན་པ་ PXD019690 དང་ཅིག་ཁར་ PRIDE མཉམ་འབྲེལ་མཛོད་ཁང་བརྒྱུད་དེ་ ProteomeXchange མཐུན་འབྲེལ་ནང་ གསོག་འཇོག་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན།
ལག་ལེན་གྱི་ མཆན་འགྲེལ་ཚུ་གིས་ དབྱེ་དཔྱད་འདི་ མཐོ་དྲགས་བཟོཝ་ཨིན། བདུན་ཕྲག་༨ ལུ་ གནས་སྡུད་ཆ་ཚན་གྱི་ ལཱ་འགན་འགྲེལ་བརྗོད་ཀྱི་ཐ་སྙད་ཚུ་གི་ ཕྱུགཔོ་འདི་ གཏན་འབེབས་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ལག་ཆས་འདི་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ལས་ཐོབ་མི་ ཟས་བཅུད་ཀྱི་ཐོ་འདི་ གཤམ་གསལ་གྱི་ཚགས་མ་ཚད་གཞི་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། ཐིག་ཁྲམ་འདི་གི་དོན་ལུ་ བདེ་སྒྲིག་འབད་ཡོད་པའི་པི་གནས་གོང་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ ཀླད་ཀོར་རེ་རེ་ནང་ དབྱེ་རིམ་ལྷག་ལུས་མཐོ་ཤོས་ལྔ་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། Benjamini, Krieger, དང་ Yekutieli (Q = 5%) གི་གནས་རིམ་གཉིས་ཀྱི་རིམ་འགྲོས་ལས་རིམ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ t-test ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་ཁག་རེ་རེ་ནང་ ངོས་འཛིན་འབད་མི་ ཁག་ཆེ་བའི་འདེམས་ངོ་ཚུ་ལུ་ དུས་ཚོད་ཀྱི་ཟས་བཅུད་བརྡ་སྟོན་དབྱེ་དཔྱད་འབད་དེ་ གྲལ་ཐིག་རེ་རེ་བཞིན་དུ་ སོ་སོ་སྦེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབདཝ་ཨིན། དུས་རྒྱུན་གྱི་ཨེསི་ཌི་ཅིག་ ངོས་ལེན་འབད་དགོཔ་མེད།
ཞིབ་འཇུག་འདི་གི་གྲུབ་འབྲས་ཚུ་ དཔར་བསྐྲུན་འབད་ཡོད་པའི་གནས་སྡུད་གཞི་རྟེན་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ག་བསྡུར་འབད་དེ་ པར་རིས་༡ པའི་ནང་ Venn གི་རི་མོ་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ MitoCarta 2.0 མཆན་འགྲེལ་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ འབོར་ཚད་ཀྱི་ཟས་བཅུད་ཐོ་ཡིག་འདི་ མཉམ་སྡེབ་འབད་ཡི། (༢༤) རི་མོ་འདི་བཟོ་བཏོན་འབད་ནི་ལུ་ ཡོངས་འབྲེལ་ལག་ཆས་ ཝེན་རི་མོ་བྲིས།
ཟས་བཅུད་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་མི་ རྩིས་དཔྱད་ཀྱི་བྱ་རིམ་ཚུ་གི་སྐོར་ལས་ ཁ་གསལ་གྱི་དོན་ལུ་ དངོས་པོ་དང་ཐབས་ལམ་གྱི་ འབྲེལ་ཡོད་དབྱེ་ཁག་ནང་ལུ་ བལྟ་གནང་། གཞན་མི་བརྟག་དཔྱད་ཚུ་ག་ར་གི་དོན་ལས་ ཁ་གསལ་གྱི་བརྡ་དོན་ཚུ་ འབྲེལ་ཡོད་གཏམ་རྒྱུད་ནང་ལུ་མཐོང་ཚུགས། དེ་མེན་པ་ཅིན་ གནས་སྡུད་ཆ་མཉམ་ སྤྱིར་སྙོམས་ ± SEM སྦེ་བཀོད་ཡོདཔ་དང་ རྩིས་དཔྱད་དབྱེ་དཔྱད་ཆ་མཉམ་ GraphPad Prism 8.1.2 མཉེན་ཆས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
རྩོམ་ཡིག་འདི་གི་དོན་ལུ་ ལྷན་ཐབས་ཀྱི་རྒྱུ་ཆ་ཚུ་གི་དོན་ལུ་ ཁ་བྱང་འདི་ནང་ལུ་གཟིགས་གནང་།
འདི་ཡང་ མཐའ་མཇུག་ལག་ལེན་འདི་ ཚོང་འབྲེལ་གྱི་ཁེ་ཕན་གྱི་དོན་ལུ་མེན་པར་ ལཱ་ངོ་མ་འདི་ བདེན་པ་ཨིན་པ་ཅིན་ བརྒྱུད་ལམ་གང་རུང་ཅིག་ནང་ ལག་ལེན་འཐབ་ནི་དང་ བཀྲམ་སྤེལ་འབད་ནི་ དེ་ལས་ བསྐྱར་བཟོ་འབད་ཆོག་པའི་ གསར་གཏོད་སྤྱིར་བཏང་གི་ ཆོག་ཐམ་གྱི་ གནས་ཚིག་ཚུ་གི་འོག་ལུ་ བཀྲམ་སྤེལ་འབད་ཡོད་པའི་ ཁ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་པའི་ རྩོམ་བྲིས་ཅིག་ཨིན། རྒྱབ་རྟེན།
དྲན་འཛིན་: ཁྱོད་ཀྱིས་ ཤོག་ལེབ་ལུ་ གྲོས་འཆར་བཀོད་མི་ མི་ངོམ་འདི་གིས་ ཁྱོད་ཀྱིས་ གློག་འཕྲིན་འདི་ བལྟ་དགོཔ་སྦེ་ ཤེས་ཚུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཁྱོད་རའི་གློག་འཕྲིན་ཁ་བྱང་འདི་ ཨིས་པམ་མེན་ཟེར་ ཤེས་ཚུགསཔ་སྦེ་ དྲིཝ་ཨིན། ང་བཅས་ཀྱིས་ གློག་འཕྲིན་ཁ་བྱང་གང་རུང་ཅིག་ བཟུང་མི་བཏུབ།
དྲི་བ་འདི་ ཁྱོད་ལྟ་བཤལཔ་ཨིན་ན་མེན་ན་ བརྟག་ཞིབ་འབད་ནི་དང་ རང་བཞིན་གྱིས་ ཨིས་པམ་གཏང་ནི་བཀག་ཐབས་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན།
ཨི་མོ་ཀྲོ་རི་ ཨའི་ཨ་ཏ་ན་སོབ་ ཨེསི་ཨེམ་ཝི་ཀོ་ཅཱན་ ཀེ་ཕོལ་ཟི་ཌོ་ནའུ་ ཝི་སག་ཐི་ཝེ་ལུ་ པི་ཇི་ཝ་ལི་སི་ཀོ་ ཨེན་ཊོ་ནི་ ཇེ་པུ་ཡལ་ ཨེན་ཇི་ཚུ་གིས་ བྲིས་ཡོདཔ་ཨིན། ལར་སོན།
ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་པའི་ རྩ་ཁམས་ཚུ་གི་ Proteomicsགིས་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལས་རིམ་འདི་ རྩ་ཁམས་ཉམས་འགྱོ་མི་འདི་ བཀག་ཐབས་ལུ་ ལཱ་འབད་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
ཨི་མོ་ཀྲོ་རི་ ཨའི་ཨ་ཏ་ན་སོབ་ ཨེསི་ཨེམ་ཝི་ཀོ་ཅཱན་ ཀེ་ཕོལ་ཟི་ཌོ་ནའུ་ ཝི་སག་ཐི་ཝེ་ལུ་ པི་ཇི་ཝ་ལི་སི་ཀོ་ ཨེན་ཊོ་ནི་ ཇེ་པུ་ཡལ་ ཨེན་ཇི་ཚུ་གིས་ བྲིས་ཡོདཔ་ཨིན། ལར་སོན།
ལཱ་འབད་མ་ཚུགས་པའི་ རྩ་ཁམས་ཚུ་གི་ Proteomicsགིས་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལས་རིམ་འདི་ རྩ་ཁམས་ཉམས་འགྱོ་མི་འདི་ བཀག་ཐབས་ལུ་ ལཱ་འབད་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
©2020 ཨ་མི་རི་ཀའི་ཚན་རིག་གོང་འཕེལ་ཚོགས་པ། ཐོབ་ཐང་ཆ་ཚང་ཉར་ཡོད། AAAS འདི་ HINARI དང་ AGORA OARE CHORUS CLOCKSS ཀོརསི་རིཕ་ དེ་ལས་ ཀའུན་ཊར་ཚུ་གི་མཉམ་འབྲེལ་པ་ཅིག་ཨིན། མཚོན་རིག་གོང་འཕེལ་ ISSN 2375-2548