ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་ཀྱི་རྫས་སྦྱོར་འདི་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་མཐའ་འཁོར་གནས་སྟངས་ཀྱི་ཁྱད་རྣམ་གཙོ་བོ་ཅིག་ཨིན་རུང་ དག་པ་ཅིག་མ་གཏོགས་ ཁོང་གི་ངོ་རྟགས་འདི་ མང་ཤོས་ཅིག་རང་ མ་ཤེས་པར་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འདི་ཁར་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ནདཔ་ཚུ་གི་ རྨེན་བུ་དང་ རྨེན་བུ་ཚུ་ལས་ རྨེན་བུ་དང་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་དེ་ འདི་བཟུམ་གྱི་ ཊི་ཨེམ་ཨི་ ཁང་མིག་སོ་སོ་ཚུ་གི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ གནས་སྟངས་ཚུ་ གསལ་སྟོན་འབད་ཡི། Ascites དང་ tumor ཁམས་ཕྲན་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་རྒྱ་ཆེཝ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། མཆིན་ནད་དང་ག་བསྡུར་འབད་བ་ཅིན་ རྨེན་བུ་ནང་འཛུལ་མི་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ 1-methylnicotinamide (MNA) ནང་ མངོན་གསལ་ཅན་སྦེ་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། Tཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ MNAགི་གནས་ཚད་འདི་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོད་རུང་ nicotinamide N-methyltransferaseགི་བརྡ་སྟོན་འདི་ fibroblastsདང་ tumorཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་རྐྱངམ་ཅིག་ཡོདཔ་ཨིན་མས། ལཱ་འགན་དང་འཁྲིལ་བ་ཅིན་ MNAགིས་ Tཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཀྲིའུ་མར་ཡར་དྲག་བཏང་མི་ cytokine tumor necrosis factor alpha བཏོན་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། དེ་འབདཝ་ལས་ ཀྲི་ཨེམ་ཨི་ལས་ཐོན་མི་ ཨེམ་ཨེན་ཨེ་གིས་ ཀྲི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ ནད་ཐུབ་ཚད་འཛིན་ལུ་ ཕན་གྲོགས་འབདཝ་མ་ཚད་ མི་གི་ཀེན་སར་གྱི་སྨན་བཅོས་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ནད་ཐུབ་སྨན་བཅོས་ཀྱི་དམིགས་གཏད་ཅིག་སྦེ་ཡང་ ངོ་བཏོནམ་ཨིན།
ཀྲིའུ་མར་ལས་ཐོན་པའི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་གིས་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་ནད་བཀག་ཐབས་ལུ་ ཕན་ཐོགས་སྦོམ་སྦེ་རང་ འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ ནད་གཞི་ཡར་འཕར་འགྱོ་ནི་ལུ་ གལ་ཆེ་བའི་ ཤུགས་རྐྱེན་ཅིག་སྦེ་ཡང་ ཕན་ཐོགས་འབྱུང་ཚུགས་པའི་ སྒྲུབ་བྱེད་མང་སུ་ཅིག་ཐོན་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། Warburg གི་ནུས་པ་གི་ཁ་སྐོང་ལུ་ འཕྲལ་ཁམས་ཅིག་གི་ལཱ་ཚུ་གིས་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ བཅུད་བསྒྱུར་གནས་སྟངས་དང་ ཀྲིའུ་མར་ཕྲ་འབུཔ་མཐའ་འཁོར་གྱི་ ནད་ཐུབ་གནས་སྟངས་དང་འབྲེལ་བ་ཚུ་ ངོས་འཛིན་འབད་ནི་འགོ་བཙུགས་ནུག བྱི་ཙི་གི་དཔེ་ཚད་དང་ མི་གི་Tཁམས་ཕྲན་གུ་ཞིབ་འཇུག་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ glutamine metabolism(༢)དང་ oxidative metabolism(༣) དེ་ལས་ glucose metabolism(༤)ཚུ་གིས་ ནད་ཐུབ་ཁམས་ཕྲན་སྡེ་ཚན་ཆུང་བ་མ་འདྲཝ་ཚུ་ནང་ རང་དབང་ཅན་སྦེ་ ལཱ་འབད་ཚུགསཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག འ་ནི་ལམ་ལུགས་ནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ལེ་ཤ་ཅིག་གིས་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་ལཱ་འགན་འདི་ བཀག་ཆ་འབདཝ་ཨིན་མས། འདི་ཡང་ coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) གིས་ T ཁམས་ཕྲན་འཕེལ་འགྱུར་ལུ་ གནོད་སྐྱོན་རྐྱབ་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ད་ གཟུགས་ནང་ལུ་ BH4 ཡར་སེང་འགྱོ་མི་འདི་གིས་ CD4 དང་ CD8 གིས་ ནད་འབུཔ་བཀག་ཐབས་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། དེ་མ་ཚད་ kynurenine གི་ནད་འགོག་ནུས་པ་འདི་ BH4 (5) བདག་སྐྱོང་གིས་ སྐྱོབ་ཚུགས། Isocitrate dehydrogenase(IDH)ནང་ལུ་ འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་མི་ glioblastomaནང་ལུ་ enantiometabolic(R)-2-hydroxyglutarate(R-2-HG)གིས་ Tཁམས་ཕྲན་ཤུགས་བཏོན་ནི་དང་ ཁྱབ་སྤེལ་འབད་ནི་ དེ་ལས་ cytolysisགི་ལས་སྣ་ཚུ་ བཀག་ཆ་འབདཝ་ཨིན་མས། འཕྲལ་ཁམས་ཅིག་ཁར་ glycolysisགི་ཐོན་སྐྱེད་ཆུང་བ་ཅིག་ཨིན་མི་ methylglyoxalའདི་ myeloidགི་ཁམས་ཕྲན་ལས་བརྟེན་ཏེ་ ཐོན་དོ་ཡོདཔ་ད་ Tཁམས་ཕྲན་གྱིས་ methylglyoxalབཏང་མི་འདི་གིས་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་ལཱ་འགན་འདི་ བཀག་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། སྨན་བཅོས་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ methylglyoxal གི་བར་མཚམས་ལུ་བཞག་མི་འདི་གིས་ myeloid-derived suppressor cells (MDSC) གི་ལས་སྣ་ཚུ་ དབང་དུ་བསྡུ་ཚུགས་ནི་ཨིནམ་མ་ཚད་ བྱི་ཙི་གི་དཔེ་ཚད་ནང་ལུ་ བརྟག་དཔྱད་བཀག་ཐབས་ཀྱི་སྨན་བཅོས་འདི་ཡང་ མཉམ་འབྲེལ་གྱི་ཐོག་ལས་ ཡར་དྲག་བཏང་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས། ཞིབ་འཇུག་འདི་གིས་ མཉམ་སྡེབ་སྦེ་ TMEལས་ཐོན་པའི་ རྫས་སྦྱོར་གྱི་འགན་ཁུར་འདི་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་ལཱ་འགན་དང་ལས་སྣ་ཚུ་ ཚད་འཛིན་འབད་ནི་ལུ་ གཙོ་བོར་བསྟེནམ་ཨིན་མས།
T cell dysfunction འདི་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་ནང་ ཁྱབ་ཆེཝ་སྦེ་ སྙན་ཞུ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (༨) འདི་ཡང་ ཆ་ཤས་ཅིག་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་ཆོས་ལས་བརྟེན་ཏེ་ཨིནམ་ད་ འདི་གིས་ glucoseདང་ tryptophanའདི་ lactic acidདང་kynurenineབཟུམ་གྱི་ཐོན་སྐྱེད་ལུ་འགྱུར་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། ཁམས་ཕྲན་གཞན་མི་ lactate མང་དྲགས་མི་འདི་གིས་ interferon-γ(IFN-γ) བཟོ་བསྐྲུན་འབད་ནི་འདི་ མར་ཕབ་འབདཝ་མ་ཚད་ myelosuppressive subgroups གི་ཁྱད་པར་ཕྱེ་ཚུགསཔ་ཨིན།(10, 11) tryptophan ཟ་སྤྱོད་འབད་མི་འདི་གིས་ T ཁམས་ཕྲན་འཕེལ་རྒྱས་འགྱོ་ནི་ལས་ ཐད་ཀར་དུ་ བཀག་ཆ་འབདཝ་མ་ཚད་ T ཁམས་ཕྲན་ལེན་མི་གི་བརྡ་མཚོན་ཚུ་ཡང་ བཀག་ཆ་འབདཝ་ཨིན། (༡༢-༡༤) འདི་བཟུམ་གྱི་བལྟ་བརྟོག་འབད་དེ་ཡོད་རུང་ ནད་ཐུབ་ཀྱི་བཅུད་གྱུར་གྱི་ལཱ་ལེ་ཤ་ཅིག་རང་ བརྡ་བརྒྱུད་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ in vitro T cell cultureནང་ལུ་ འགོ་འདྲེན་འཐབ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ མི་གི་ཀེན་སར་དང་ གཟུགས་ཁམས་རིག་པའི་མཐའ་འཁོར་གནས་སྟངས་ཚུ་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་རང་ མ་སྟོནམ་ཨིན་མས།
མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་ཁྱད་ཆོས་གཙོ་བོ་འདི་ མངལ་སྒོའི་ནད་གཞི་ཁྱབ་སྤེལ་འགྱོ་མི་དང་ མངལ་སྒོའི་ནད་གཞི་ཐོན་མི་ཚུ་ཨིན། མཆིན་པའི་ནང་ཁམས་ཕྲན་ཆུ་བསྡུ་གསོག་འབད་མི་འདི་ ནད་གཞི་གོང་འཕེལ་འགྱོ་མི་དང་ ནད་གཞི་སྔོན་དཔག་ལེགས་ཤོམ་མེད་མི་དང་འབྲེལ་བ་ཡོདཔ་ཨིན། (༡༥) སྙན་ཞུ་དང་འཁྲིལ་བ་ཅིན་ འདི་བཟུམ་གྱི་ གཞན་དང་མ་འདྲ་བའི་ ཁང་མིག་འདི་ རླུང་མ་མེདཔ་ལས་ ཁྲག་རྒྱུན་གྱི་ ཡར་རྒྱས་ཀྱི་རྒྱུ་རྐྱེན་ (VEGF) དང་ indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ལས་ T regulatory cells དང་ myeloid inhibitory cells (15-18) ཚུ་གིས་ ནང་ན་འཛུལ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། བཅུད་འགྱུར་གྱི་མཐའ་འཁོར་གནས་སྟངས་འདི་ རྨེན་བུ་ལས་སོ་སོ་སྦེ་འོང་ནི་འདི་གིས་ ཕོཝ་གི་ས་སྒོ་ནང་ལུ་ Tཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ལོག་སྟེ་ལས་རིམ་བཟོ་ནི་འདི་ གསལ་ཏོག་ཏོ་ཅིག་མེདཔ་ཨིན་མས། འདི་གི་ཁ་སྐོང་ལུ་ རྨེན་བུ་གི་མཐའ་འཁོར་ནང་ལུ་ཡོད་པའི་ ascitesདང་ metabolitesགི་བར་ན་ ཁྱད་པར་དང་ མ་འདྲཝ་སྦེ་ཡོད་མི་འདི་གིས་ རྨེན་བུ་གི་ནང་ལུ་ ནད་ཐུབ་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ནང་ན་འཛུལ་ནི་དང་ ཁོང་གི་ལཱ་འགན་ཚུ་ བར་ཆད་རྐྱབ་དོ་ཡོདཔ་ལས་ ཞིབ་འཚོལ་འཕྲོ་མཐུད་དེ་རང་འབད་དགོཔ་འདུག
འདི་བཟུམ་གྱི་དཀའ་ངལ་སེལ་ཐབས་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཁམས་ཕྲན་མ་འདྲཝ་ཚུ་ ཞིབ་འཇུག་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཚོར་ཤུགས་ཅན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་ཁ་ཕྱེ་ནི་དང་ ཁུ་བ་གི་ཚོས་གཞི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ཐབས་ལམ་འདི་ བཟོ་བཀོད་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། ང་བཅས་ཀྱིས་ ཐབས་ལམ་འདི་ མི་རློབས་གཙོ་བོ་ཚུ་གི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་ཚད་མཐོ་དྲགས་སྦེ་བཏོན་ནི་གི་དོན་ལུ་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོད་མི་ cytometryདང་ ཁམས་ཕྲན་གཅིག་གི་ RNAགོ་རིམ་སྒྲིག་ནི་(scRNA-seq)དང་གཅིག་ཁར་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ ཀྲིའུ་མར་ཊི་ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ ༡-མེ་ཐིལ་ནི་ཀོ་ཊི་ནམ་མའིཌ་ (MNA) གི་གནས་ཚད་འདི་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ཡོདཔ་ད་ ཝི་ཊོ་གི་བརྟག་དཔྱད་ནང་ལུ་ ཨེམ་ཨེན་ཨེ་གིས་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ལཱ་འགན་ལུ་ ནད་འབུཔ་བཀག་ཐབས་ཀྱི་ནུས་པ་འདི་ ཧེ་མ་ལས་ མ་ཤེས་པར་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག སྤྱིར་བཏང་ལུ་ ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ ཀྲིའུ་མར་དང་ ནད་ཐུབ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་འབྲེལ་བ་ཚུ་ གསལ་སྟོན་འབདཝ་མ་ཚད་ ནད་ཐུབ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ནང་ལུ་ གཞན་དང་མ་འདྲ་བའི་ ཤེས་རྟོགས་བྱིན་དོ་ཡོདཔ་ལས་ འདི་གིས་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་སྨན་བཅོས་ལུ་ ཁག་ཆེ་ཤོས་ཅིག་ཨིན་མས།
ང་ཚོས་མཐོ་ཚད་མཐོ་བའི་བཞུར་རྒྱུན་ཕྲ་ཕུང་ཚད་འཇལ་ཆས་སྤྱད་དེ་དུས་མཉམ་དུ་གུ་གུལ་གྱི་ཚད་གཞི་འཇལ་ཡོད། ནད་འགོག་ཁམས་ཕྲན་དང་ རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་དབྱེ་བ་ཕྱེ་ཚུགས་པའི་ སྤྱིར་བཏང་གི་རྟགས་མཚན་ཚུ། (ཐིག་ཁྲམ་S2 དང་པར་རིས་S1A) འ་ནི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ T ཁམས་ཕྲན་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ ascites དང་ tumor ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ གུ་རམ་གྱི་ཚད་གཞི་མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་ནང་ལུ་ ཁྱད་པར་ཆུང་ཀུ་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག གུ་རུའི་ཚད་གཞི་འདི་ CD45-EpCAM (EpCAM)+] གིས་ T ཁམས་ཕྲན་ལས་ ཚར་གསུམ་ལས་བཞི་ཚུན་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ད་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་གྱིས་ གུ་རུའི་ཚད་གཞི་འདི་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ལས་ ཚར་༡.༢ དེ་ཅིག་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་འདི་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་དང་ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ཡོདཔ་ད་ ཁམས་ཕྲན་གཉིས་ཆ་རའི་ནང་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་འདི་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ལས་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། སྤྱིར་བཏང་ལུ་ གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་ཚད་འདི་ གསལ་སྟོན་འབདཝ་ཨིན། རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཟས་བཅུད་བསྒྱུར་བཅོས་ཀྱི་ལས་སྣ་དེ་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་ལས་མཐོ་བ་དང་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཟས་བཅུད་བསྒྱུར་བཅོས་ཀྱི་ལས་སྣ་དེ་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ལས་མཐོ་བ་ཡོད། ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་ཚུ་ནང་ འདི་བཟུམ་གྱི་གནོད་པ་ཡོད་རུང་ CD4+དང་CD8+Tཁམས་ཕྲན་གྱི་ནང་ལུ་ བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་གནས་ཚད་དང་ ཡང་ན་ རྨེན་བུ་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ ཁྲག་འབབ་ཀྱི་ཚད་གཞི་ནང་ལུ་ ཁྱད་པར་ག་ནི་ཡང་མེདཔ་ཨིན་མས། དེ་ལས་ CD45-cell fraction ནང་ལུ་ EpCAM+ ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཚད་གཞི་འདི་ ascites དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། ང་བཅས་ཀྱིས་ EpCAM+ དང་ EpCAM- ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཆ་ཤས་ཚུ་གི་བར་ན་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་གསལ་ཏོག་ཏོ་སྦེ་མཐོང་ཡི། EpCAM+(tumor)ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ EpCAM-ཁམས་ཕྲན་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ glucose uptakeདང་ mitochondrialགི་ལས་སྣ་མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ TMEནང་ལུ་ཡོད་པའི་ tumorཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ fibroblastsགི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལས་སྣ་ལས་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན་མས།
(ཀ དང་ ཁ) གུ་རུའི་འོད་ཀྱི་ཤུགས་ཚད་ (MFI) དང་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ mitochondrial ལས་སྣ་ (MitoTracker dark red) (ཁ) ངོ་ཚབ་ཐིག་ཁྲམ་ (གཡོན་ཕྱོགས) དང་ ཐིག་ཁྲམ་གནས་སྡུད་ (གཡས) CD8 + T ཁམས་ཕྲན་དང་ EpCAM + T ཁམས་ཕྲན་དང་ EpCAM + CDtusci a ལས་ tumor. (C) CD4 + དང་ CD8 + ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཆ་ཚད་ (CD3 + T ཁམས་ཕྲན་གྱི་) མཆིན་ཚད་དང་རྨེན་བུ་ནང་། (D) མཆིན་ཚད་དང་རྨེན་བུ་ནང་ EpCAM + རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཆ་སྙོམས། (CD45−) (E དང་ F) EpCAM + CD45-tumor དང་ EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) དང་ mitochondrial ལས་རིམ་ (MitoTracker dark red) (F) ངོ་ཚབ་ཀྱི་ཐིག་ཁྲམ་ (གཡོན་ཕྱོགས) དང་ ཐིག་ཁྲམ་གནས་སྡུད་ (གཡས) མཆིན་ཚད་དང་རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན། (G) CD25, CD137 དང་ PD1 གི་ངོ་ཚབ་ཐིག་ཁྲམ་ཚུ་ ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཊི་རི་གིས་ བརྡ་སྟོན་འབདཝ་ཨིན། (H དང་ I) CD25, CD137 དང་ PD1 བརྡ་སྟོན། CD4 + T ཁམས་ཕྲན་ (H) དང་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ (I) ཐོག་ལ། (J དང་ K) CCR7 དང་ CD45RO གི་བརྡ་སྟོན་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ Naive དང་ དབུས་དྲན་ཤེས་ (Tcm) དེ་ལས་ ཕན་ནུས་ཅན་ (Teff) དང་ ཕན་ནུས་ཅན་གྱི་དྲན་ཤེས་ (Tem) ཕེ་ནོ་ཊའིཔ་ཚུ་ཨིན། CD4 + T ཁམས་ཕྲན་ (J) དང་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ (K) གི་ ངོ་ཚབ་པར་རིས་ (གཡོན) དང་ ཐིག་ཁྲམ་གནས་སྡུད་ (གཡས་ཕྱོགས) ཚུ་ མཆིནམ་དང་ རྨེན་བུ་ཚུ་ནང་ ཡོདཔ་ཨིན། P གནས་གོང་ཚུ་ ཆ་སྒྲིག་ཅན་གྱི་ t-བརྟག་དཔྱད་ (*P<0.05, **P<0.01 དང་ ***P<0.001) གིས་གཏན་འབེབས་བཟོཝ་ཨིན། གྲལ་ཐིག་འདི་གིས་ མཐུན་སྒྲིག་འབད་མི་ནདཔ་ཚུ་སྟོནམ་ཨིན། (n = 6) FMO, འོད་མདངས་ཕབ་གཅིག; MFI, འོད་འཚེར་གྱི་ཤུགས་ཚད་བར་མ།
ད་རུང་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ T cell phenotypic གི་གནས་རིམ་གྱི་བར་ན་ ཁྱད་པར་གལ་ཅན་གཞན་མི་ཚུ་ཡང་ ཐོན་ནུག རྨེན་བུ་ནང་ལུ་ ཤུགས་ལྡན་བཟོ་མི་ (པར་རིས་༡ པ་ལས་ G ལས་ I) དང་ ནུས་པ་ཅན་གྱི་དྲན་ཤེས་ (པར་རིས་༡ པ་ J དང་ K) འདི་ མཆིནམ་གྱི་ནད་གཞི་ལས་ མངམ་སྦེ་རང་ འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་བཟུམ་སྦེ་ མི་རློབས་འདི་ཚུ་གི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་ཆོས་ཚུ་ སོ་སོ་སྦེ་ཡོད་རུང་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་གལ་ཅན་ཅིག་མེདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། F ལས་ I)། འདི་བཟུམ་གྱི་གྲུབ་འབྲས་ཚུ་ འཕྲུལ་ཆས་ལྷབ་སྦྱང་གི་ཐབས་ལམ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ རང་བཞིན་གྱིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཕེ་ནོ་ཊའིཔ་ཚུ་ བཀོད་སྒྲིག་འབད་དེ་ ངེས་གཏན་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། ངོས་འཛིན་འབད་ཡོད་པའི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་རིགས་ཚུ་གི་གྲལ་ལས་ myeloidཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་འདི་གིས་ glucose དང་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་མཐོ་ཤོས་ཅིག་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན།(པར་རིས་S2, B to G) འ་ནི་གྲུབ་འབྲས་ཚུ་གིས་ HGSC ནདཔ་ཚུ་ལུ་ ascites དང་ tumors ནང་ལུ་མཐོང་མི་ ཁམས་ཕྲན་མ་འདྲཝ་ཚུ་གི་བར་ན་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་ཤུགས་ཅན་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབདཝ་ཨིན།
ཊི་ཨའི་ཨེལ་གྱི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་ཆོས་ཚུ་ཧ་གོ་ནི་ལུ་ གདོང་ལེན་ངོ་མ་རང་ ཀྲི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་དཔེ་ཚད་ཚུ་ ལངམ་སྦེ་ བཙག་འཐུ་དང་ སྤུས་ཚད་ དེ་ལས་ འབོར་ཚད་ཚུ་ རྨེན་བུ་ལས་ སོ་སོ་སྦེ་ བཏོན་དགོཔ་འདི་ཨིན། འཕྲལ་ཁམས་ཀྱི་ ཞིབ་འཇུག་ཚུ་གིས་ ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཊི་རི་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་དང་ ཕྱེངམ་ཕྱུགཔོ་བཟོ་ནི་གི་ཐབས་ལམ་ཚུ་གིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་བཅུད་བསྒྱུར་གྱི་ གནས་སྡུད་ཚུ་ འགྱུར་བཅོས་འགྱོ་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ནུག(༢༢-༢༤) དཀའ་ངལ་འདི་བསལ་ཐབས་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ LC-MS/MS གིས་ དབྱེ་དཔྱད་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ གཤག་བཅོས་འབད་དེ་ མི་གི་མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་ལས་ TIL སོ་སོ་སྦེ་བཞག་ནི་དང་ སོ་སོ་སྦེ་བཞག་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཕྱེངམ་ཕྱུགཔོ་བཟོ་ནི་གི་ཐབས་ལམ་འདི་ ཡར་དྲག་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་བཟུམ་གྱི་མཐུན་སྒྲིག་འདི་གིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་འགྱུར་བ་ལུ་ སྤྱིར་བཏང་གི་ཕན་གནོད་བལྟ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ གོང་འཁོད་ཀྱི་ ཕྲེང་ཁ་ཕྱེ་བའི་གོ་རིམ་གྱི་ཤུལ་ལས་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་བྱིན་མི་ཚུ་གིས་ ལཱ་འབད་བཅུག་མི་ T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་སྡུད་ཚུ་ ཕྲེང་ཁ་ཕྱེ་མ་ཚུགས་རུང་ འཁྱེག་གུ་ལུས་མི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ག་བསྡུར་འབད་ཡི། འདི་བཟུམ་གྱི་སྤུས་ཚད་ཚད་འཛིན་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ གནས་སྟངས་གཉིས་ཀྱི་བར་ན་ འབྲེལ་བ་མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་འབདཝ་ལས་ ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ བཅུད་གྱུར་གྱི་དབྱེ་དཔྱད་ཚུ་ གཏན་གཏན་སྦེ་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ལས་ HGSCནང་ལུ་ བཅུད་གྱུར་གྱི་རིགས་ཚུ་ངོས་འཛིན་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཐབས་ལམ་འགོ་དང་པ་ཅིག་ཐོབ་སྟེ་ མི་ཚུ་གིས་ འདོད་སྤྱོད་ཀྱི་བཅུད་གྱུར་ལས་རིམ་གྱི་སྐོར་ལས་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ཧ་གོ་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས།
(ཀ) ཁབ་ལེན་ཕྲེང་བ་ཕྱུགཔོ་བཟོ་བའི་ རིམ་སྒྲིག་རི་མོ། LC-MS/MS གིས་ དབྱེ་དཔྱད་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ རིམ་བཞིན་དུ་ མེག་ནི་ཊིག་བིཌ་ མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་ སྐོར་ཐེངས་གསུམ་འགྱོ་འོང་ ཡང་ན་ འཁྱེག་གུ་ལུ་ ལུས་འོང་། (ཁ) བཅུད་འགྱུར་གྱི་མང་ཚད་ལུ་ མཐོ་དྲགས་བཟོ་བའི་དབྱེ་བ་གི་ནུས་པ། ཕྱུགཔོ་བཟོ་བའི་དབྱེ་བ་རེ་རེའི་དོན་ལུ་ འཇལ་ཚད་གསུམ་གྱི་ཆ་སྙོམས། ± SE. གྲལ་ཐིག་ཐལཝ་འདི་གིས་ ༡:༡ མཐུན་འབྲེལ་སྟོནམ་ཨིན། ཚངས་ཐིག་ཁ་ཡིག་ནང་སྟོན་ཡོད་པའི་བསྐྱར་ལོག་འཇལ་ཚད་ཀྱི་ནང་འཁོད་དབྱེ་རིམ་འབྲེལ་བ་ (ICC)། NAD, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་ཨེ་ཌི་ནིན་ཌའི་ནིའུ་ཀི་ལོ་ཊའིཌ། (C) ནད་པའི་བཅུད་འགྱུར་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་ལཱ་གི་རྒྱུན་རིམ་གྱི་རིམ་སྒྲིག་རི་མོ། Ascites ཡང་ན་ tumors ཚུ་ ནདཔ་ཚུ་ལས་ བསྡུ་ལེན་འབད་དེ་ cryopreserved འབདཝ་ཨིན། དཔེ་ཚད་རེ་རེ་གི་ཆ་ཤས་ཆུང་ཀུ་ཅིག་ flow cytometry གི་ཐོག་ལས་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ད་ ལྷག་ལུས་དཔེ་ཚད་ཚུ་ CD4+ དང་ CD8+ དེ་ལས་ CD45- ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གི་དོན་ལས་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ སྐོར་ཐེངས་གསུམ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་འདི་ཚུ་ LC-MS/MS ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (D) ཚད་ལྡན་གྱི་བཅུད་འགྱུར་གྱི་མང་ཚད་ཀྱི་དྲོད་ཚད་ཀྱི་སབ་ཁྲ། ཌེན་གྲོ་གཱརམ་འདི་གིས་ དཔེ་ཚད་ཚུ་གི་བར་ན་ ཨིཝ་ཀི་ལི་དྲིའན་ཐག་རིང་ཐུང་འདི་ ཝརགྲ་གི་སྡེ་ཚན་སྦེ་བཟོ་མི་འདི་ ངོ་བཏོནམ་ཨིན། (E) དཔེ་ཚད་ཀྱི་ བཅུད་འགྱུར་སབ་ཁྲ་གི་ ཆ་ཤས་གཙོ་བོ་དབྱེ་དཔྱད་ (PCA) དཔེ་ཚད་རེ་རེ་གི་འདྲ་དཔེ་གསུམ་སྟོན་ཏེ་ ནདཔ་གཅིག་ལས་ དཔེ་ཚད་ཚུ་ ཐིག་གཅིག་གིས་ མཐུད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། (F) ནད་པའི་ཐོག་ལུ་གནས་སྟངས་བཟོ་ཡོད་པའི་དཔེ་ཚད་ཀྱི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གསལ་སྡུད་ཀྱི་ PCA ༼དེ་ཡང་ ཆ་ཤས་ལྷག་ལུས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་༽ དཔེ་ཚད་དབྱེ་བ་འདི་ འབུར་གཟུགས་ཀྱི་ གྲུ་གཟིངས་ཀྱིས་ ཚད་འཛིན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། PC1, གཙོ་བོ་ཆ་ཤས་ ༡; PC2, ཆ་ཤས་གཙོ་བོ་ ༢།
དེ་ལས་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཐབས་ལམ་འདི་ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ CD4 +, CD8 + དང་ CD45-cell fractions ནང་ 99 metabolites དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ད་ དེ་ཡང་ HGSC ནདཔ་དྲུག་གི་ གཞི་རྟེན་ ascites དང་ tumors ནང་ཡོདཔ་ཨིན། ཁེ་ཕན་གྱི་མི་རློབས་འདི་ སྲོག་ལྡན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་སྦོམ་གྱི་དཔེ་ཚད་ངོ་མ་གི་བརྒྱ་ཆ་༢ལས་༧༠གི་བར་ན་འབདཝ་ཨིནམ་དང་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཚད་གཞི་འདི་ ནདཔ་ཚུ་གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་སྦོམ་སྦེ་ར་ཡོདཔ་ཨིན། ཕྱེངམ་ཚུ་ཁ་ཕྱེ་ཞིནམ་ལས་ སྤྱིར་སྙོམས་ལུ་ དཔེ་ཚད་ནང་ལུ་ སྲོག་ལྡན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་ཆ་མཉམ་ལས་ བརྒྱ་ཆ་༨༥ལྷགཔ་ཅིག་ ཁེ་ཕན་གྱི་དཔྱ་རྩིས་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། འ་ནི་ཕྱུགཔོ་བཟོ་ནི་གི་ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ མི་གི་རྨེན་བུ་གི་རྩ་ཕྲན་ཚུ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་ཚུ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཚུགསཔ་ཨིནམ་དང་ འདི་ཡང་ དཔེ་ཚད་སྦོམ་ཚུ་ལས་ འབད་མ་ཚུགསཔ་ཨིན། འ་ནི་མཐུན་གྲོས་འདི་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ l-kynurenine དང་ adenosine འདི་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ཁྱད་ཆོས་ལྡན་པའི་ ནད་འབུབ་བཀག་ཐབས་ཀྱི་ རྫས་སྦྱོར་གཉིས་ རྨེན་བུ་ T ཁམས་ཕྲན་ཡང་ན་ རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན་ནང་ ཡར་སེང་འགྱོ་ཡོདཔ་སྦེ་ ངོས་འཛིན་འབད་ཡི། (པར་རིས་ S3, B དང་ C) དེ་འབདཝ་ལས་ འ་ནི་གྲུབ་འབྲས་ཚུ་གིས་ ང་བཅས་རའི་ཁམས་ཕྲན་ཁ་ཕྱེ་ནི་དང་ ནདཔ་གི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལུ་ སྐྱེ་ལྡན་རིག་པའི་ཁག་ཆེ་བའི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་ འཚོལ་ནི་གི་དོན་ལས་ འཕྲུལ་རིག་ཚུ་གི་ བློ་གཏད་དང་ ལྕོགས་གྲུབ་ཚུ་ སྟོནམ་ཨིན།
ང་བཅས་ཀྱི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ ནདཔ་གི་ནང་འཁོད་དང་ བར་ན་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་ཚུ་ ཤུགས་ཅན་སྦེ་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ཚུགསཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་༢D ​​དང་ པར་རིས་S༤A) དམིགས་བསལ་དུ་ ནདཔ་གཞན་ཚུ་དང་ག་བསྡུར་འབད་བ་ཅིན་ ནདཔ་༧༠ གིས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་ཆོས་སོ་སོ་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། གཞན་མི་ནདཔ་ཚུ་དང་ཕྱདཔ་ད་ ༼ལི་ཊར་༡.༢ ལས་༢ ཚུན་ ཐིག་ཁྲམ་ཨེས་༡༽ ནདཔ་༧༠ ལུ་ བསྡོམས་རྩིས་བསྡུ་ལེན་འབད་མི་ མཆིནམ་གྱི་ཚད་གཞི་འདི་ ཉུང་སུ་ཅིག་ལས་བརྒལ་མེདཔ་ཨིན་མས། ཆ་ཤས་གཙོ་བོའི་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་སྐབས་ལུ་ ནདཔ་གི་བར་ན་ལུ་ མ་འདྲཝ་སྦེ་ཡོད་མི་འདི་ ཚད་འཛིན་འབད་མི་འདི་གིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་ཚུ་གི་བར་ན་ འགྱུར་བ་འབྱུང་དོ་ཡོདཔ་ད་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་དང་ ཡང་ན་ མཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་ཚུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་སྡུད་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ གསལ་ཏོག་ཏོ་སྦེ་ བསྡུ་སྒྲིག་འབདཝ་ཨིན་མས། བཅུད་འགྱུར་གྱི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ འ་ནི་གནོད་པ་ཚུ་ལུ་ གཙོ་བོར་བསྟེན་ཡོདཔ་མ་ཚད་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་དང་ མཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་གལ་ཅན་ཅིག་ མཐོང་ནུག ཁྱད་པར་ཆེ་ཤོས་མཐོང་བའི་ MNA འདི་ CD45- ཁམས་ཕྲན་དང་ CD4+ དང་ CD8+ ཁམས་ཕྲན་ནང་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ལས་ རྨེན་བུ་ནང་འཛུལ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ ༣ཀ) CD4+ཁམས་ཕྲན་གྱི་དོན་ལུ་ འ་ནི་གནོད་པ་འདི་ མངོན་གསལ་ཅན་ཅིག་ཨིནམ་མ་ཚད་ CD8+ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ཡོད་པའི་ MNAའདི་ཡང་ མཐའ་འཁོར་གནས་སྟངས་ཀྱིས་ ཤུགས་སྦེ་རང་ གནོད་པ་བརྐྱབ་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ཨིན་རུང་ འདི་ཡང་ ཁག་ཆེཝ་ཅིག་མེན་པས། MNA གི་ཁ་སྐོང་ལུ་ ascites དང་ tumor གི་ཁམས་ཕྲན་མ་འདྲཝ་ཚུ་ནང་ TIL ནང་ལུ་ ཁྱད་ཆོས་ལེགས་ཤོམ་མེད་མི་ གཞན་མི་ metabolites ཚུ་ཡང་ ཁྱད་པར་ཅན་སྦེ་ ཕྱུགཔོ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ S3 དང་ S4) དེ་འབདཝ་ལས་ གནས་སྡུད་འདི་ཚུ་གིས་ ཞིབ་འཚོལ་གྱི་དོན་ལས་ ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་འབད་མི་ རྫས་སྦྱོར་གྱི་ ཁས་བླངས་ཅན་གྱི་ཆ་ཚན་ཅིག་ གསལ་བཏོན་འབདཝ་ཨིན།
(ཀ) CD4+, CD8+ དང་ CD45- ཁམས་ཕྲན་ནང་ MNA གི་ནང་དོན་སྤྱིར་བཏང་བཟོ་ཡོདཔ། སྒྲོམ་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་འདི་གིས་ བར་མཚམས་(གྲལ་ཐིག་) དང་ བར་མཚམས་ཁྱབ་ཚད་(གཞི་ཁྲམ་གྱི་མཐུད་མཚམས་) དེ་ལས་ གནད་སྡུད་ཁྱབ་ཚད་ བར་མཚམས་ཁྱབ་ཚད་(གཞི་ཁྲམ་ཝིསི་ཀར་) ཚར་༡.༥ ཚུན་སྟོནམ་ཨིན། ནད་པའི་རྒྱུ་ཆ་དང་ཐབས་ལམ་ནང་གསལ་བཀོད་འབད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ ནདཔ་གི་ལི་མ་གནས་གོང་འདི་ P གནས་གོང་གཏན་འབེབས་བཟོ་ནི་ལུ་ལག་ལེན་འཐབ། (*P<0.05 དང་ **P<0.01) (B) MNA བཅུད་འགྱུར་གྱི་རིམ་སྒྲིག་རི་མོ། (60). བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་: S-ཨེ་ཌི་ནོ་སིལ་-༡-མེ་ཐིའོ་ནིན། SAH, S-ཨེ་ཌི་ནོ་སིན་-༡-ཧོ་མོ་སི་ཊིན་; NA, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི།; MNA, 1-མེ་ཐིལ་ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི།; 2-PY, 1-མེ་ཐིལ་- 2-པི་རི་ཌོན་-5-ཀར་བོཀ་སི་མཱའིཌ།; 4-PY, 1-མེ་ཐིལ་-4-པི་རི་ཌོན་-5-ཀར་བོཀ་ས་མའི་ཌི། NR, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་རའི་བོས།; NMN, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་མོ་ནོ་ནིའུ་ཀི་ལོ་ཊའིཌ། བཞུ་ཁུ་ (ལྗང་ཁུ): NNMT, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་ N-མེ་ཐིལ་ཊཱན་ཊརན་ཕེ་རེསི། SIRT, སིར་ཊུའིན་; NAMPT, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་ཕོསི་ཕོ་རི་བོ་སིལ་སྤོ་བཤུད་; AOX1, ཨེལ་ཌི་ཧའི་ཌི་ཨོག་སི་ཌེ་སི་ ༡; NRK, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་རི་བོ་སའིཌ་ཀི་ནེ་སི།; NMNAT, ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་མོ་ནོ་ནིའུ་ཀི་ལོ་ཊའིཌ་ཨེ་ཌི་ནི་ལེ་ཊི་སྤོ་བཤུད་; Pnp1, པུ་རིན་ནིའུ་ཀི་ལོ་སའིཌ་ཕོསི་ཕོ་རི་ལེསི། (C) t-SNE གི་ scRNA-seq གི་ མཆིན་ཚད་ (སྐྱ་བོ་) དང་ རྨེན་བུ་ (དམརཔོ་; n = ནད་པ་ ༣)། (D) scRNA-seq ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ངོས་འཛིན་འབད་མི་ ཁམས་ཕྲན་མི་རློབས་སོ་སོའི་ནང་ NNMT བརྡ་སྟོན། (E) SK-OV-3 དང་ མི་སྒོང་ཕྲུག་གི་མཆིནམ་ (HEK) 293T དེ་ལས་ T ཁམས་ཕྲན་དང་ MNA གིས་སྨན་བཅོས་འབད་མི་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ནང་ NNMT དང་ AOX1 གི་བརྡ་སྟོན། བཀབ་ཡོད་པའི་གསལ་བརྗོད་འདི་ SK-OV-3 དང་འབྲེལ་བ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན། SEM དང་མཉམ་དུ་བརྡ་སྟོན་བཀོད་རིས་འདི་སྟོན་ཡོད། (n = 6 གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མཁན།) ༣༥ ལས་མཐོ་བའི་ Ct གནས་གོང་ཚུ་ ཤེས་རྟོགས་མ་འབད་བར་ (ཡུ་ཌི་) སྦེ་བརྩིཝ་ཨིན། (F) SK-OV-3, HEK293T, T ཁམས་ཕྲན་དང་ 8mM MNA དང་མཉམ་དུ་སྨན་བཅོས་བྱས་པའི་T ཁམས་ཕྲན་ནང་ SLC22A1 དང་ SLC22A2 གི་བརྡ་སྟོན། བཀབ་ཡོད་པའི་གསལ་བརྗོད་འདི་ SK-OV-3 དང་འབྲེལ་བ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན། SEM དང་མཉམ་དུ་བརྡ་སྟོན་བཀོད་རིས་འདི་སྟོན་ཡོད། (n = 6 གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མཁན།) ༣༥ ལས་མཐོ་བའི་ Ct གནས་གོང་ཚུ་ ཤེས་རྟོགས་མ་འབད་བར་ (ཡུ་ཌི་) སྦེ་བརྩིཝ་ཨིན། (G) ཁམས་ཕྲན་ཨེམ་ཨེན་ཨེ་ནང་དོན་ ཆུ་ཚོད་༧༢ གི་རིང་ལུ་ ཨེམ་ཨེན་ཨེ་དང་གཅིག་ཁར་ འཕྱེལ་འགྱོ་བའི་ཤུལ་ལས་ ཤུགས་ལྡན་བཟོ་ཡོད་པའི་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་བྱིན་མི་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་ནང་། SEM དང་མཉམ་དུ་བརྡ་སྟོན་གྱི་དཔེ་རིས་འདི་སྟོན་ཡོད། (n = 4 གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མཁན།)
MNAའདི་ S-adenosyl-1-methionine(SAM)ལས་ མི་ཐིལ་སྡེ་ཚན་འདི་ ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་(NA)ལུ་ ནི་ཀོ་ཊི་ན་མའི་ཌི་N-methyltransferase(NNMT; Figure 3B)གིས་ སྤོ་བཤུད་འབད་དེ་ བཏོནམ་ཨིན་མས། NNMT འདི་ མི་གི་ཀེན་སར་མ་འདྲཝ་ཚུ་ནང་ མངོན་གསལ་ཆེ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་ལས་ ཁྱབ་སྤེལ་དང་ བཙན་འཛུལ་ དེ་ལས་ ཁྱབ་སྤེལ་ཚུ་དང་ འབྲེལ་བ་ཡོདཔ་ཨིན། (༢༥-༢༧) TME ནང་ལུ་ T ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ MNA གི་འབྱུང་ཁུངས་འདི་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ཧ་གོ་ཐབས་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ scRNA-seq ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ HGSC ནདཔ་གསུམ་གྱི་ ascites དང་ tumors ནང་ལུ་ NNMT གི་རྣམ་པ་ཚུ་ ཁྱད་ཆོས་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་༦༥༠༠དེ་ཅིག་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ ཁྲག་འབབ་དང་ རྨེན་བུ་གི་མཐའ་འཁོར་ནང་ལུ་ NNMTགི་བརྡ་སྟོན་འདི་ fibroblastདང་ རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་ལུ་ བཀག་ཆ་འབད་དེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག མི་རློབས་གང་རུང་ཅིག་ནང་ PTPRC (CD45 +) (པར་རིས་ ༣D དང་ པར་རིས་ S5A) བཏོན་མི་ NNMT གི་བརྡ་སྟོན་འདི་ གསལ་ཏོག་ཏོ་ཅིག་མེདཔ་ལས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་འོད་རླབས་ནང་ལུ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་མི་ MNA འདི་ T ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ འགོ་བཙུགས་ཡོདཔ་སྦེ་ བརྡ་སྟོནམ་ཨིན་མས། བརྡ་སྟོན་གྱི་ aldehyde oxidase 1 (AOX1) གིས་ MNA འདི་ ༡-མི་ཐིལ་-༢-པི་རི་ཌོན་-༥-ཀར་བོཀ་ས་མའི་ཌི་ (༢-PYR) ཡང་ན་ ༡-མི་ཐིལ་-༤-པི་རི་ཌོན་-༥-ཀར་བོ་ཀ་ས་མའི་ཌི་ (༤- PYR) ལུ་བསྒྱུར་བཅོས་འབདཝ་ཨིན། པར་རིས་༣B)འདི་ COL1A1(པར་རིས་S5A)བཏོན་མི་ fibroblastsགི་མི་རློབས་ལུ་ཡང་ བཀག་ཆ་འབད་དེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ Tཁམས་ཕྲན་ལུ་ སྔར་སྲོལ་གྱི་MNAབཅུད་འགྱུར་གྱི་ལྕོགས་གྲུབ་མེདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན་མས། འ་ནི་MNAདང་འབྲེལ་བའི་རིགས་མཚན་ཚུ་གི་བརྡ་སྟོན་གྱི་དཔེ་རིས་འདི་ HGSCནདཔ་ཚུ་ལས་ རང་དབང་ཅན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་གནས་སྡུད་ཆ་ཚན་གཉིས་པ་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བདེན་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་S5B; n = 6) (16) དེ་མ་ཚད་ ཚད་འཛིན་གྱི་ polymerase chain reaction (qPCR) གིས་ MNA དང་ཅིག་ཁར་སྨན་བཅོས་འབད་མི་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་འབད་མི་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཚད་འཛིན་འབད་མི་ SK-OV-3 ovarian tumor cells དང་ཕྱདཔ་ད་ NNMT ཡང་ན་ AOX1 འདི་ ཧ་ལམ་ཅིག་ གསལ་སྟོན་འབད་མ་ཚུགསཔ་སྦེ་ མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན། འ་ནི་རེ་བ་མེད་པའི་གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ MNAའདི་ fibroblastsདང་ ཡང་ན་ tumorལས་ TMEགི་ཉེ་འདབས་ལུ་ཡོད་པའི་ Tཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ བཏོན་བཏང་འོང་ཟེར་ཨིན་མས།
འདེམས་ངོ་ཚུ་ཡང་ རང་བཞིན་གྱི་ ཀེ་ཊི་ཡོན་སྐྱེལ་འདྲེན་འབད་མི་ ༡ ལས་ ༣ ཚུན་ (OCT1, OCT2 དང་ OCT3) ཚུ་ བཞུ་ཚུགས་པའི་ སྐྱེལ་འདྲེན་འབད་མི་ ༢༢ (SLC22) བཟའ་ཚང་ (SLC22A1, SLC22A2 དང་ SLC22A3) གིས་ བཀོད་སྒྲིག་འབད་དེ་ཡོད་རུང་ MNA གི་འོས་འབབ་ཅན་གྱི་སྐྱེལ་འདྲེན་འབད་མི་ཚུ་ ད་ལྟོ་ཡང་ གསལ་བཀོད་འབད་དེ་མེདཔ་ཨིན། གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མི་ T ཁམས་ཕྲན་ལས་ mRNA གི་ QPCR གིས་ SLC22A1 གི་བརྡ་སྟོན་གནས་ཚད་དམའ་ཤོས་ཅིག་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ SLC22A2 གི་གནས་ཚད་བརྟག་དཔྱད་མ་འབད་བར་ཡོདཔ་ལས་ ཧེ་མ་ལས་ རྩོམ་རིག་ནང་ སྙན་ཞུ་འབད་དེ་ཡོདཔ་སྦེ་ ངེས་གཏན་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ ༣F) (༢༩) དེ་ལས་ SK-OV-3 ovarian tumor cell line གིས་ སྐྱེལ་འདྲེན་གཉིས་ཆ་རའི་གནས་ཚད་མཐོ་དྲགས་སྦེ་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ ༣F)
ཕྱི་རྒྱལ་གྱི་ཨེམ་ཨེན་ཨེ་ བཙུགས་ཚུགས་པའི་ ལྕོགས་གྲུབ་ཡོད་པའི་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་འབད་མི་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཨེམ་ཨེན་ཨེ་གི་ ཆ་ཚད་མ་འདྲཝ་ཡོད་པའི་ དུས་ཡུན་ཆུ་ཚོད་༧༢ གི་རིང་ལུ་ འཚོ་སྐྱོང་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཕྱི་རོལ་གྱི་MNA མེད་པའི་སྐབས་ MNA གི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ནང་དོན་ཤེས་རྟོགས་མི་ཐུབ།(པར་རིས་ ༣G) ཨིན་རུང་ ཕྱི་ཁའི་MNA དང་ཅིག་ཁར་ སྨན་བཅོས་འབད་མི་ activated T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ MNA གི་ནང་དོན་འདི་ སྨན་ཁབ་ལུ་བརྟེན་པའི་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ 6 mM MNA ཚུན་ཚོད་ མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ ༣G) གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ སྐྱེལ་འདྲེན་གྱི་གནས་ཚད་དམའ་ཤོས་དང་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ MNAགི་རྫས་སྦྱོར་གྱི་འགན་ཁུར་འབག་མི་ བཞུ་ཁུ་མེད་རུང་ TILགིས་ MNAའདི་ ད་ལྟོ་ཡང་ལེན་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།
ནདཔ་གི་Tཁམས་ཕྲན་དང་ in vitro MNA ཐིམ་ནི་གི་བརྟག་དཔྱད་འདི་གིས་ ཀེན་སར་དང་འབྲེལ་བའི་ fibroblasts(CAF)གིས་ MNAབཏོན་ནི་གི་འོས་འབབ་ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ད་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་གྱིས་ TILགི་ལཱ་འགན་དང་ ལཱ་འགན་ཚུ་ ཚད་འཛིན་འབད་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས། Tཁམས་ཕྲན་ལུ་ MNAགིས་ ཕན་གནོད་ག་དེ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན་ན་བལྟ་ནི་གི་དོན་ལས་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་བྱིན་མི་Tཁམས་ཕྲན་འདི་ MNAཡོད་མེད་ནང་ལུ་ ཝི་ཊོ་ནང་ལུ་ ལཱ་འབད་བཅུག་སྟེ་ འདི་གི་འཕེལ་འགྱུར་དང་ cytokineབཟོ་བསྐྲུན་འདི་ དབྱེ་ཞིབ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཉིནམ་༧ གྱི་རིང་ལུ་ སྨན་ཁབ་མཐོ་ཤོས་ནང་ MNA ཁ་སྐོང་བཀོད་པའི་ཤུལ་ལས་ མི་རློབས་གཉིས་ལྡབ་ཀྱི་གྱངས་ཁ་འདི་ བར་མཚམས་ཅིག་ཁར་ མར་ཕབ་འགྱོ་ཡོདཔ་ད་ སྨན་ཁབ་ག་རའི་ནང་ ནུས་ཤུགས་འདི་ བདག་འཛིན་འཐབ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་མ་ཚད་ exogenous MNA སྨན་བཅོས་འབད་བའི་སྐབས་ CD4 + དང་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཚད་གཞི་ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ tumor necrosis factor-α (TNFα; Figure 4B) བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ IFN-γ ཐོན་སྐྱེད་འདི་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ མར་ཕབ་འགྱོ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ མར་ཕབ་མ་འགྱོ་བར་ཡོདཔ་ལས་ interleukin 2 (IL-2; Figure 4, C and D) ནང་ལུ་ འགྱུར་བ་སྦོམ་སྦེ་རང་ མ་བྱུངམ་ཨིན་མས། དེ་འབདཝ་ལས་ འ་ནི་MNA-treated T cell cultures ལས་ supernatants གི་ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) གིས་ TNFα ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ IFN-γ མར་ཕབ་འགྱོ་སྟེ་ IL-2 འགྱུར་བ་མེདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག། . IFN-γ མར་ཕབ་འགྱོ་མི་འདི་གིས་ MNA གིས་ T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ རྨེན་བུ་བཀག་ཐབས་ལུ་ འགན་ཁུར་འབག་འོང་ཟེར་ཨིན་མས། MNAགིས་ Tཁམས་ཕྲན་བརྒྱུད་དེ་ cytotoxicityལུ་ གནོད་པ་ཡོདཔ་སྦེ་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ chimeric antigen receptor T(FRα-CAR-T)ཁམས་ཕྲན་འདི་ folate receptorαདང་CAR-T(GFP)ལུ་དམིགས་གཏད་བསྐྱེད་དེ་ འཚོ་བཅུད་ལྗང་ཁུ་གིས་ ཚད་འཛིན་འབདཝ་ཨིན་མས། CAR-T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ MNA ཡོད་པའི་སྐབས་ལུ་ ཆུ་ཚོད་༢༤གི་རིང་ལུ་ འཚོ་སྐྱོང་འབད་ཞིནམ་ལས་ མི་གི་ SK-OV-3 ovarian tumor cells དང་ཅིག་ཁར་ དམིགས་གཏད་ཀྱི་ཆ་ཚད་༡༠:༡ གི་ནང་ལུ་ folate receptor α བཏོནམ་ཨིན། MNA སྨན་བཅོས་འབད་བའི་སྐབས་ FRα-CAR-T ཁམས་ཕྲན་གྱི་བསད་པའི་ལས་སྣ་འདི་ མར་ཕབ་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ FRα-CAR-T ཁམས་ཕྲན་འདི་ adenosine གིས་སྨན་བཅོས་འབད་མི་དང་ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།(པར་རིས་ ༤H)
(ཀ) ཉིནམ་༧ པའི་ནང་ ལམ་སྲོལ་ལས་ ཐད་ཀར་དུ་ ཁམས་ཕྲན་གྱངས་ཁ་དང་ མི་རློབས་གཉིས་ལྡབ་འགྱོ་མི་ (PD) ཐིག་ཁྲམ་འདི་གིས་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མི་དྲུག་གི་ སྤྱིར་སྙོམས་ + SEM ངོ་བཏོནམ་ཨིན། ཉུང་མཐའ་ n = 3 རང་དབང་ཅན་གྱི་བརྟག་དཔྱད་ལས་ གནད་སྡུད་ཚུ་ངོ་བཏོནམ་ཨིན། (B to D) CD3/CD28 དང་ IL-2 ཚུ་ ཉིནམ་༧ གྱི་རིང་ལུ་ རང་སོའི་ MNA གི་ཚད་གཞི་ནང་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ལཱ་འབད་བཅུག་ནིའི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ནུག། དབྱེ་དཔྱད་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ GolgiStop དང་ཅིག་ཁར་ PMA/ionomycin གིས་ ཆུ་ཚོད་༤ གི་རིང་ལུ་ སྐུལ་མ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། TNFα (B) བརྡ་སྟོན། T ཁམས་ཕྲན་ནང་། དཔེར་ན་ པར་རིས་ (གཡོན) དང་ ཐིག་ཁྲམ་གནས་སྡུད་ (གཡས) སྲོག་ལྡན་ཁམས་ཕྲན་ནང་ TNFα བརྡ་སྟོན་གྱི་ ཐིག་ཁྲམ། T ཁམས་ཕྲན་ནང་ IFN-γ (C) དང་ IL-2 (D) བརྡ་སྟོན། cytokinesགི་བརྡ་སྟོན་འདི་ flow cytometryགི་ཐོག་ལས་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། ཐིག་ཁྲམ་འདི་གིས་ སྤྱིར་སྙོམས་ (n = 6 གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མི་) + SEM ངོས་འཛིན་འབདཝ་ཨིན། P གནས་གོང་གཏན་འབེབས་བཟོ་ནིའི་དོན་ལུ་ འགྱུར་ལྡོག་དང་ བསྐྱར་ལོག་འཇལ་ཚད་ཀྱི་ ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད་ལག་ལེན་འཐབ། (*P<0.05 དང་ **P<0.01) ཉུང་མཐའ་ n = 3 རང་དབང་ཅན་གྱི་བརྟག་དཔྱད་ལས་ གནད་སྡུད་ཚུ་ངོ་བཏོནམ་ཨིན། (E to G) CD3/CD28 དང་ IL-2 ཚུ་ ཉིནམ་༧ གྱི་རིང་ལུ་ རང་སོའི་ MNA གི་ཚད་གཞི་ནང་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ལཱ་འབད་བཅུག་ནིའི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ནུག། བརྒྱུད་ལམ་འདི་ PMA/ionomycin stimulation གི་ཧེ་མ་དང་ ཆུ་ཚོད་༤ གི་ཤུལ་ལས་ བསྡུ་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། TNFα (E) དང་ IFN-γ (F) དེ་ལས་ IL-2 (G) གི་ཚད་གཞི་ཚུ་ ELISA གིས་འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། ཐིག་ཁྲམ་འདི་གིས་ སྤྱིར་སྙོམས་ (n = 5 གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མི་) + SEM ངོས་འཛིན་འབདཝ་ཨིན། P གནས་གོང་འདི་ འགྱུར་ལྡོག་དང་ བསྐྱར་ལོག་འཇལ་ཚད་ཀྱི་ ཕྱོགས་གཅིག་དབྱེ་དཔྱད་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ གཏན་འབེབས་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། (*P<0.05) ཚག་ཅན་གྱི་གྲལ་ཐིག་འདི་གིས་ བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་བརྟག་དཔྱད་ཚད་གཞི་འདི་བརྡ་སྟོནམ་ཨིན། (H) ཁམས་ཕྲན་ lysis བརྟག་དཔྱད། FRα-CAR-T ཡང་ན་ GFP-CAR-T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ adenosine (250μM) ཡང་ན་ MNA (10 mM) དང་ཅིག་ཁར་ ཆུ་ཚོད་༢༤ གི་རིང་ལུ་ བདེ་སྒྲིག་འབད་དེ་ ཡང་ན་ སྨན་བཅོས་མ་འབད་བར་བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། (Ctrl) SK-OV-3 ཁམས་ཕྲན་གྱི་བརྒྱ་ཆ་བསད་ཚད་འཇལ་ཡོད། ཝེལ་ཆི་ཊི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱིས་གཏན་འབེབས་འབད་མི་ P གནས་གོང་ (*P<0.5 དང་ **P<0.01)།
MNAལུ་བརྟེན་པའི་ TNFαགི་བརྡ་སྟོན་ལམ་ལུགས་ཀྱི་སྐོར་ལས་ འཕྲུལ་རིག་གི་གོ་རྟོགས་ཐོབ་ནི་གི་དོན་ལུ་ MNAལུ་སྨན་བཅོས་འབད་མི་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་ TNFα mRNAགི་འགྱུར་བ་ཚུ་ དབྱེ་ཞིབ་འབད་ནུག(པར་རིས་༥ཀ) MNAགིས་སྨན་བཅོས་འབད་མི་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་བྱིན་མི་Tཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ TNFαཡིག་བསྒྱུར་གྱི་གནས་ཚད་འདི་ ཚར་གཉིས་ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ལས་ MNAའདི་ TNFαཡིག་བསྒྱུར་གྱི་ལམ་ལུགས་ལུ་བརྟེན་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། འ་ནི་ཐབས་ལམ་འདི་ ཞིབ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ TNFαལུ་ཚད་འཛིན་འབད་མི་ ཡིག་བསྒྱུར་གྱི་ཆ་རྐྱེན་གཉིས་ activated T cell nuclear factor (NFAT)དང་ དམིགས་བསལ་གྱི་ཟས་བཅུད་༡(Sp1)འདི་ MNAགིས་ proximal TNFαགོང་འཕེལ་བཏང་མི་ལུ་ ལན་གསལ་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ དབྱེ་ཞིབ་འབད་ནུག TNFα ཁྱབ་སྤེལ་འབད་མི་ནང་ ངོས་འཛིན་འབད་ཡོད་པའི་ NFAT མཐུད་སའི་ས་ཁོངས་ ༦ དང་ Sp1 མཐུད་སའི་ས་ཁོངས་ ༢ ཡོདཔ་ད་ ས་ཁོངས་གཅིག་ནང་ གཅིག་ཁར་བསྡོམས་ཏེ་ཡོདཔ་ཨིན། [5'cap ལས་ -55 base pairs (bp)] (30) Chromatin immunoprecipitation (ChIP) གིས་ MNA དང་ཅིག་ཁར་ སྨན་བཅོས་འབད་བའི་སྐབས་ Sp1 དང་ TNFα གོང་འཕེལ་བཏང་མི་ལུ་ མཐུད་དེ་ ཚར་གསུམ་ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ མཐོང་ནུག NFAT མཉམ་འབྲེལ་གྱིས་ཡང་ ཡར་སེང་འབད་དེ་ ཁག་ཆེ་ཧིང་ལུ་ ཐུག་ཡོདཔ་ཨིན། (པར་རིས་ ༥ ཁ) གནས་སྡུད་འདི་གིས་ MNAགིས་ Sp1གི་ཐོག་ལས་ TNFαགི་རྣམ་པ་ལུ་ ཚད་འཛིན་འབདཝ་ཨིནམ་མ་ཚད་ NFATགི་རྣམ་པ་ཡང་ ཉུང་སུ་ཅིག་ལས་བརྒལ་མེདཔ་སྦེ་བཏོནམ་ཨིན་མས།
(ཀ) ཨེམ་ཨེན་ཨེ་མེད་པར་ འཚོ་སྐྱོང་འབད་མི་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་དང་ག་བསྡུར་འབད་བ་ཅིན་ ཨེམ་ཨེན་ཨེ་དང་གཅིག་ཁར་ སྨན་བཅོས་འབད་མི་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་ནང་ ཊི་ཨེན་ཨེཕ་α བརྡ་སྟོན་གྱི་ འགྱུར་བ་འདི་ བསྒྱུར་བཅོས་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། SEM དང་ཅིག་ཁར་ བརྡ་སྟོན་གྱི་དཔེ་རིས་འདི་སྟོན་ཡོདཔ་ཨིན། (n = 5 གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་ཕུལ་མཁན།) ཉུང་མཐའ་ n = 3 རང་དབང་ཅན་གྱི་བརྟག་དཔྱད་ལས་ གནད་སྡུད་ཚུ་ངོ་བཏོནམ་ཨིན། (ཁ) NFAT དང་ Sp1 གི་ཤུལ་ལས་ 8 mM MNA དང་ཡང་ན་མེད་པར་སྨན་བཅོས་འབད་མི་ T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ TNFα ཁྱབ་སྤེལ་འབད་མི་འདི་ (Ctrl) དང་ PMA/ionomycin stimulation ཆུ་ཚོད་ ༤ གི་རིང་ལུ་ མཉམ་སྡེབ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་ལུ་ Immunoglobulin G (IgG) དང་ H3 འདི་ ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་ལུ་ ངན་པ་དང་ ངེས་གཏན་གྱི་ཚད་འཛིན་སྦེ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ChIP གི་འབོར་ཚད་འདི་གིས་ Sp1 དང་ NFAT གིས་ MNA སྨན་བཅོས་འབད་མི་ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ TNFα གོང་འཕེལ་བཏང་མི་ལུ་ མཐུད་དེ་ཡོད་མི་འདི་ ཚད་འཛིན་འབད་མི་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ ཚར་ལེ་ཤ་ཅིག་རང་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག ཉུང་མཐའ་ n = 3 རང་དབང་ཅན་གྱི་བརྟག་དཔྱད་ལས་ གནད་སྡུད་ཚུ་ངོ་བཏོནམ་ཨིན། P གནས་གོང་འདི་ སྣ་མང་ t-བརྟག་དཔྱད་ (*** P <0.01) གིས་གཏན་འབེབས་བཟོཝ་ཨིན། (C) HGSC གི་ ascites དང་ཕྱདཔ་ད་ T cells (non-cytotoxic) གིས་ རྨེན་བུ་ནང་ TNF གི་བརྡ་སྟོན་ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ཡོདཔ་ཨིན། ཚོས་གཞི་ཚུ་གིས་ ནདཔ་སོ་སོ་ཚུ་སྟོནམ་ཨིན། བཀྲམ་སྟོན་འབད་ཡོད་པའི་ནང་ཐིག་ཚུ་ གང་བྱུང་སྦེ་ ༣༠༠ ལུ་དཔེ་ཚད་བཏོན་ཡོདཔ་དང་ ཚད་འཛིན་འབད་ནི་ལུ་ ཇི་ཊར་འབད་ཡོདཔ་ཨིན་ (** Padj = ༠.༠༠༧༦)། (D) མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་དོན་ལུ་ MNA གི་དཔེ་ཚད་གྲོས་འཆར་བཀོད་ཡོདཔ། MNAའདི་ TMEནང་ལུ་ཡོད་པའི་ tumorཁམས་ཕྲན་དང་ fibroblastsནང་ལུ་བཟོ་སྟེ་ Tཁམས་ཕྲན་གྱིས་ ལེན་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། MNAགིས་ Sp1དང་ TNFαགོང་འཕེལ་བཏང་མི་ལུ་ མཐུད་ནི་འདི་ ཡར་སེང་འགྱོ་སྟེ་ TNFαགི་ཡིག་བསྒྱུར་དང་ TNFαགི་ cytokineབཟོ་བསྐྲུན་འདི་ ཡར་སེང་འགྱོ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། MNA གིས་ཡང་ IFN-γ མར་ཕབ་འབདཝ་ཨིན། T cell གི་ལས་འགན་བཀག་ཐབས་འབད་མི་འདི་གིས་ བསད་ནི་གི་ལྕོགས་གྲུབ་མར་ཕབ་འབད་དེ་ རྨེན་བུ་གི་འཕེལ་འགྱུར་མགྱོགས་དྲགས་འགྱོཝ་ཨིན།
སྙན་ཞུ་དང་འཁྲིལ་བ་ཅིན་ TNFα ལུ་ གདོང་དང་རྒྱབ་ལུ་བརྟེན་པའི་ རྨེན་བུ་དང་ རྨེན་བུ་ལུ་ ཕན་ཐོགས་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་ ཡར་རྒྱས་དང་ ཁྱབ་སྤེལ་འབད་ནི་ལུ་ ཡོངས་གྲགས་ཅན་གྱི་འགན་ཁུར་འབགཔ་ཨིན། (༣༡-༣༣) སྙན་ཞུ་དང་འཁྲིལ་བ་ཅིན་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་ནདཔ་ཚུ་ལུ་ མཆིནམ་གྱི་ཀེན་སར་དང་ མཆིནམ་གྱི་རྩ་ཕྲན་ནང་ TNFα གི་ཚད་གཞི་འདི་ ནད་གཞི་མེད་པའི་རྩ་ཕྲན་ལས་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།(༣༤-༣༦) ཐབས་ལམ་གྱི་ཐད་ལུ་ TNFα གིས་ ཁྲག་ཁམས་ཕྲན་དཀརཔོ་གི་ ཤུགས་ལྡན་དང་ ལཱ་འགན་ དེ་ལས་ ཁྱབ་སྤེལ་ཚུ་ ཚད་འཛིན་འབད་ཚུགསཔ་མ་ཚད་ ཀེན་སར་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ ཕེ་ནོ་ཊའིཔ་ཡང་ འགྱུར་བཅོས་འབད་ཚུགསཔ་ཨིན། (༣༧, ༣༨) ཞིབ་འཇུག་འདི་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ རིགས་མཚན་གྱི་ཁྱད་པར་དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ TNFའདི་ ascitesདང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ Tཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག(པར་རིས་༥C) TNFགི་རྣམ་པ་ཡར་སེང་འགྱོ་མི་འདི་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་ནང་ལུ་རྐྱངམ་ཅིག་མཐོང་ཚུགས་ནུག(པར་རིས་S5A) བཅུད་བསྡུས་ནང་ལུ་ གནས་སྡུད་འདི་གིས་ MNAལུ་ HGSCནང་ལུ་ ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་དང་ རྨེན་བུ་ཡར་དྲག་བཏང་ནི་གི་ནུས་པ་གཉིས་ཡོདཔ་སྦེ་བཀོད་མི་ལུ་ རྒྱབ་སྐྱོར་འབདཝ་ཨིན་མས།
ཕོལོ་སའི་ཀྲོ་མེ་ཀྲི་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ འོད་མདངས་ཅན་གྱི་ཁ་ཡིག་བཏགས་ནི་འདི་ ཊི་ཨའི་ཨེལ་བཅུད་འགྱུར་གྱི་སྐོར་ལས་ ཞིབ་འཇུག་འབད་ནི་གི་ཐབས་ལམ་ངོ་མ་ཅིག་ལུ་འགྱུར་ཡོདཔ་ཨིན། ཞིབ་འཇུག་འདི་གིས་ ཁྲག་གི་ lymphocytes དང་ ཡང་ན་ T cells དང་ཅིག་ཁར་ ག་བསྡུར་འབད་བ་ཅིན་ murine དང་ human TIL གིས་ glucose མཐོ་དྲགས་སྦེ་ ལེན་ཚུགས་པའི་ འོས་འབབ་ཡོདཔ་སྦེ་ མཐོང་ནུག ང་བཅས་ཀྱིས་ ཞིབ་འཇུག་འདི་ནང་ གྲུབ་འབྲས་ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ གོང་འཕེལ་གྱི་གཙོ་བོ་འདི་ རྨེན་བུ་གི་ཁམས་ཕྲན་དང་ རྨེན་བུ་གི་རྩ་ཕྲན་གཅིག་ལས་ ཊི་ཨའི་ཨེལ་གྱི་ བཅུད་བསྒྱུར་འདི་ ག་བསྡུར་འབད་ནི་འདི་ཨིན། ཧེ་མའི་སྙན་ཞུ་ཚུ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ ཀྲིའུ་མར་(CD45-EpCAM +) ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ CD8+ དང་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ གུ་རམ་གྱི་ཚད་གཞི་མཐོ་དྲགས་སྦེ་བཏོན་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ལས་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ གུ་རམ་གྱི་ཚད་གཞི་མཐོ་དྲགས་སྦེ་ ལེན་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། T cell འགྲན་བསྡུར་གྱི་བསམ་གཞི། TME. ཨིན་རུང་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་འདི་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ལས་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོད་རུང་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་འདི་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་དང་ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན། འ་ནི་གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་གྱི་དོན་ལུ་ བཙོག་པ་གི་རྫས་སྦྱོར་འདི་ ཁག་ཆེཝ་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ད་རུང་ ཁོང་གིས་ CD8+Tཁམས་ཕྲན་འདི་ CD4+Tཁམས་ཕྲན་དང་ཕྱདཔ་ད་ལུ་ བཙའ་ཐལ་འགྱོ་ནི་གི་ཉེན་ཁ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། ང་བཅས་ཀྱིས་ CD4 + T effectors དང་ T effector memory དེ་ལས་ T central memory cells ཚུ་གི་བར་ན་ གུ་རུ་བླུགས་ནི་དང་ ཡང་ན་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་ཚུ་གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་མེདཔ་སྦེ་ མཐོང་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་བཟུམ་སྦེ་ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་གྱི་ཁྱད་པར་དེ་ གུ་རམ་གྱི་འགྱུར་བ་དང་ འབྲེལ་བ་མེདཔ་ལས་ vitro དང་ མི་གི་ TIL གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་གལ་ཅན་ཅིག་ གསལ་སྟོན་འབདཝ་ཨིན་མས། འ་ནི་བལྟ་བརྟོག་འདི་ཡང་ ཕྱོགས་ལྷུང་མེད་པའི་རང་བཞིན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་མི་རློབས་བགོ་བཀྲམ་གྱི་ཐོག་ལས་ ངེས་གཏན་བཟོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ glucoseམཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོད་མི་དང་ mitochondrialགི་ལས་སྣ་འདི་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་ལས་ ཁྱབ་ཆེཝ་སྦེ་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ Metabolic active cell populationཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། འ་ནི་མི་རློབས་འདི་གིས་ scRNA-seqདབྱེ་དཔྱད་ནང་ལུ་ ངོས་འཛིན་འབད་མི་ myeloid suppressorཁམས་ཕྲན་དང་ ཡང་ན་ plasmacytoid dendriticཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་ཡན་ལག་ཅིག་ཨིན་མས། འདི་གཉིས་ཆ་ར་ མི་གི་མངལ་སྒོ་གི་རྨེན་བུ་ནང་ལུ་ སྙན་ཞུ་འབད་དེ་ཡོད་རུང་ ད་ལྟོ་ཡང་ ལཱ་གཞན་ཅིག་འབད་དགོཔ་འདི་ myeloid subpopulation འདི་ འགྲེལ་བཤད་རྐྱབ་དགོཔ་ཨིན་མས།
flow cytometryལུ་གཞི་བཞག་པའི་ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ glucoseདང་ oxidative metabolismགི་ཁྱད་པར་ཚུ་ གསལ་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཚུགས་རུང་ glucoseདང་ ཡང་ན་ TMEནང་ལུ་ mitochondrial metabolismགི་དོན་ལུ་ ནག་རྫས་ཐོན་མི་ཚུ་ ད་ལྟོ་ཡང་ ཐག་མ་བཅད་པར་ཡོདཔ་ཨིན་མས། TILགི་ཆ་ཤེས་ཅིག་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཡོད་མེད་ཀྱི་འགན་སྤྲོད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་འདི་ བཏོན་བཏང་མི་གི་རྩ་ཕྲན་ནང་ལས་ གཙང་སྦྲ་བཟོ་དགོཔ་ཨིན་མས། དེ་འབདཝ་ལས་ ང་བཅས་རའི་ཁམས་ཕྲན་མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་ཐབས་ལམ་འདི་ mass spectrometry དང་ཅིག་ཁར་བསྡོམས་ཏེ་ ནདཔ་གི་དཔེ་ཚད་ཚུ་དང་མཐུན་སྒྲིག་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ T ཁམས་ཕྲན་དང་ ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་གྱི་མི་རློབས་ཚུ་ ཁྱད་པར་ཕྱེ་སྟེ་ མཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོད་མི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་སྐོར་ལས་ ཤེས་རྟོགས་བྱིན་ཚུགས། ཐབས་ལམ་འདི་ལུ་ འོད་མདངས་ཅན་གྱི་ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་ལས་ ཁེ་ཕན་ཡོད་རུང་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་དཔེ་མཛོད་ལ་ལུ་ཅིག་ རང་བཞིན་གྱི་བརྟན་ཏོག་ཏོ་དང་ ཡང་ན་ མགྱོགས་དྲགས་སྦེ་ ཚོང་འབྲེལ་གྱི་ཚད་གཞི་ལས་བརྟེན་ཏེ་ ཐོ་ཕོག་འོང་། ཨིན་རུང་ ང་བཅས་ཀྱི་ཐབས་ལམ་འདི་གིས་ དཔེ་ཚད་ཀྱི་དབྱེ་བ་ཚུ་གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་སྦོམ་སྦེ་ར་ཡོདཔ་ལས་ ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་འབད་མི་ རྫས་སྦྱོར་གཉིས་ ངོས་འཛིན་འབད་ཚུགས་ཏེ་ཡོདཔ་ཨིན།
ང་བཅས་ཀྱིས་ རྨེན་བུ་དང་ TIL གི་དབྱེ་བ་ཚུ་གི་སྐོར་ལས་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་མི་འདི་གིས་ མངལ་སྒོ་གི་ TME ནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་འགན་ཁུར་གྱི་སྐོར་ལས་ ཤེས་རྟོགས་མང་སུ་ཅིག་བྱིནམ་ཨིན། དང་པ་ flow cytometry ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ རྨེན་བུ་དང་ CD4 + T ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ mitochondrial གི་ལས་སྣ་ནང་ ཁྱད་པར་མེདཔ་སྦེ་ ངོས་འཛིན་འབད་ཡི། ཨིན་རུང་ LC-MS/MSགིས་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་བའི་སྐབས་ལུ་ མི་རློབས་འདི་ཚུ་གི་ནང་འཁོད་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་མངམ་སྦེ་ཡོད་མི་ནང་ འགྱུར་བ་སྦོམ་སྦེ་རང་ཐོན་ཡོདཔ་ལས་ TILགི་བཅུད་འགྱུར་དང་ སྤྱིར་བཏང་བཅུད་འགྱུར་གྱི་ལཱ་ཚུ་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་ དོན་འགྲེལ་འབད་དགོཔ་སྦེ་ཨིན་མས། གཉིས་པ་ལུ་ MNA འདི་ CD45-cells དང་ T cells གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་སྦོམ་ཤོས་ཡོད་མི་ metabolite ཨིན། འདི་འབདཝ་ལས་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་དང་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་ས་སྒོ་འདི་གིས་ TILགི་བཅུད་བསྒྱུར་ལུ་ གནོད་པ་མ་འདྲཝ་སྦེ་འོང་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་གིས་ མཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་ནང་ལུ་ མ་འདྲཝ་སྦེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། གསུམ་པ་ MNA-producing enzyme NNMT གི་བརྡ་སྟོན་འདི་ ངོ་མ་རང་ CAF ལུ་ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ རྨེན་བུ་གི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཉུང་སུ་ཅིག་ལས་བརྒལ་མེད་རུང་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ཚུགས་པའི་ MNA གི་གནས་ཚད་འདི་ རྨེན་བུ་ལས་ཐོན་པའི་ T ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ མཐོང་ཚུགསཔ་ཨིན་མས། མངལ་སྒོ་ནང་ལུ་ NNMTགིས་ ཀེན་སར་གྱི་ནད་གཞི་ཐོན་མི་འདི་གིས་ ཀེན་སར་གྱི་ནད་གཞི་ཐོན་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ CAFགི་བཅུད་འགྱུར་དང་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་བཙན་འཛུལ་ དེ་ལས་ ནད་གཞི་ཁྱབ་སྤེལ་འགྱོ་མི་ལུ་བརྟེན་ཏེ་ཨིན་མས། སྤྱིར་བཏང་ལུ་ TILགི་གནས་ཚད་འདི་ བར་མཚམས་ཅིག་ཨིན་རུང་ CAFནང་ལུ་ NNMTགི་བརྡ་སྟོན་འདི་ Cancer Genome Atlas(TCGA) mesenchymal subtypeདང་འབྲེལ་བ་ཡོདཔ་ལས་ འདི་ཡང་ ནད་གཞི་འདི་ ལེགས་ཤོམ་སྦེ་མ་ཤེས་པར་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས།(27, 46, 47) མཐའ་མཇུག་ཁར་ MNAམར་ཕབ་འབད་ནི་གི་འགན་ཁུར་འབག་མི་ enzyme AOX1གི་བརྡ་སྟོན་འདི་ CAFགི་མི་རློབས་ལུ་ཡང་ ཚད་འཛིན་འབད་དེ་ཡོདཔ་ལས་ Tཁམས་ཕྲན་ལུ་ MNAབསྒྱུར་བཅོས་འབད་ནི་གི་ལྕོགས་གྲུབ་མེདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན་མས། འ་ནི་གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ ཞིབ་འཇུག་འདི་བདེན་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ལཱ་ལྷག་སྟེ་འབད་དགོཔ་ཡོད་རུང་ Tཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ MNAམཐོ་དྲགས་སྦེ་ཡོད་མི་འདི་གིས་ ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་འབད་མི་ CAFམཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན་མས།
MNAསྐྱེལ་འདྲེན་གྱི་གནས་ཚད་དམའ་ཤོས་དང་ MNAགི་རྫས་སྦྱོར་ནང་ལུ་འབྲེལ་གཏོགས་ཡོད་པའི་ འཚོ་བཅུད་ཀྱི་གནས་ཚད་ཤེས་རྟོགས་མ་ཚུགས་མི་ལུ་བརྟེན་ཏེ་ Tཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ MNAཡོད་མི་འདི་ རེ་བ་མེདཔ་ཅིག་ཨིན་མས། NNMT དང་ AOX1 གཉིས་ཆ་ར་ scRNA-seq དབྱེ་དཔྱད་དང་ རང་དབང་ཅན་གྱི་སྡེ་ཚན་གཉིས་ཀྱི་ དམིགས་གཏད་ qPCR གིས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་མ་ཚུགས། འ་ནི་གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ MNAའདི་ Tཁམས་ཕྲན་གྱིས་ མཉམ་སྦྱོར་མ་འབད་བར་ མཐའ་འཁོར་གྱི་TMEལས་ བཙུགས་དོ་ཡོདཔ་སྦེ་སྟོནམ་ཨིན་མས། In vitro གི་བརྟག་དཔྱད་ནང་ལུ་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ exogenous MNA བསྡུ་གསོག་འབད་ནི་གི་ འོས་འབབ་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག
ང་བཅས་རའི་ in vitro ཞིབ་འཇུག་གིས་ exogenous MNA གིས་ T ཁམས་ཕྲན་ནང་ལུ་ TNFα གི་རྣམ་པ་བཏོན་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་མ་ཚད་ Sp1 འདི་ TNFα གོང་འཕེལ་བཏང་མི་ལུ་ མཐུད་དེ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིན་མས། TNFα ལུ་ རྨེན་བུ་དང་ རྨེན་བུ་གཉིས་ཆ་ར་ བཀག་ཐབས་འབད་ནིའི་ ལཱ་འགན་ཡོད་རུང་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་ནང་ TNFα གིས་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་ ཡར་རྒྱས་འགྱོ་ནི་ལུ་ ཕན་ཐོགས་འབྱུང་ཚུགས། (31-33) མངལ་སྒོའི་རྨེན་བུ་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ལམ་སྲོལ་ནང་ལུ་ TNFα བར་ལུ་བཞག་ནི་དང་ ཡང་ན་ བྱི་ཙི་གི་དཔེ་ཚད་ནང་ལུ་ TNFα བརྡ་མཚོན་མེདཔ་བཟོ་མི་འདི་གིས་ TNFα-mediated inflammatory cytokine བཟོ་བསྐྲུན་ཡར་དྲག་བཏང་ནི་དང་ རྨེན་བུ་ཡར་འཕར་འགྱོ་ནི་འདི་ བཀག་ཚུགས།(32, 35) དེ་འབདཝ་ལས་ གནད་དོན་འདི་ནང་ལུ་ TMEལས་ཐོན་པའི་MNAགིས་ TNFαལུ་བརྟེན་པའི་ཐབས་ལམ་བརྒྱུད་དེ་ autocrine loopབརྒྱུད་དེ་ pro-inflammatory metaboliteཅིག་སྦེ་ལཱ་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ལས་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་ནད་གཞི་ཐོན་ནི་དང་ཁྱབ་སྤེལ་འགྱོ་ནི་ལུ་ ཕན་ཐོགས་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་ལུ་གཞི་བཞག་སྟེ་ TNFα blockade འདི་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་དོན་ལུ་ སྨན་བཅོས་འབད་ནི་གི་འོས་འབབ་ཅིག་སྦེ་ ཞིབ་འཇུག་འབད་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། (37, 48, 49) འདི་གི་ཁ་སྐོང་ལུ་ MNAགིས་ CAR-Tཁམས་ཕྲན་གྱི་ cytotoxicityའདི་ མངལ་སྒོ་གི་ཀྲིའུ་མར་ཁམས་ཕྲན་ལུ་ ཉམས་བཅུག་དོ་ཡོདཔ་ལས་ MNAགིས་ ནད་ཐུབ་བཀག་ཐབས་ལུ་ སྒྲུབ་བྱེད་ཁ་སྐོང་བྱིནམ་ཨིན་མས། མཉམ་སྡེབ་འབད་བ་ཅིན་ གྲུབ་འབྲས་འདི་གིས་ ཀྲིའུ་མར་དང་ CAFཁམས་ཕྲན་ཚུ་གིས་ MNAའདི་ ཁམས་ཕྲན་གཞན་མི་TMEནང་ལུ་བཏོན་མི་གི་དཔེ་ཚད་ཅིག་ བསམ་འཆར་བཀོད་ནུག ༼༡༽ TNF གིས་ མངལ་སྒོའི་ཀེན་སར་གྱི་ ཡར་འཕར་གྱི་ སྐུལ་སློང་དང་ ༼༢༽ MNA གིས་ T cell cytotoxic ལས་སྣ་ཚུ་ བཀག་ཆ་འབད་མི་འདི་གིས་ འདི་གིས་ རྨེན་བུ་གཉིས་ལྡན་གྱི་ གནོད་པ་འབྱུང་སྲིད་ནི་ཨིན་མས།
མཇུག་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་མགྱོགས་དྲགས་སྦེ་ཡར་དྲག་བཏང་ནི་དང་ ཁམས་ཕྲན་གཅིག་གི་གོ་རིམ་ དེ་ལས་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་སྡུད་ཚུ་ མཉམ་སྡེབ་འབད་དེ་ ཞིབ་འཇུག་འདི་གིས་ HGSCནདཔ་ཚུ་ལུ་ ཀྲིའུ་མར་དང་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ ནད་རིགས་བཀག་ཐབས་ཀྱི་ཁྱད་པར་སྦོམ་སྦེ་རང་ཡོདཔ་སྦེ་ གསལ་སྟོན་འབད་ནུག འ་ནི་ཡོངས་སུ་རྫོགས་པའི་དབྱེ་དཔྱད་འདི་གིས་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ glucoseདང་ mitochondrialགི་ལས་སྣ་ཚུ་གི་བར་ན་ ཁྱད་པར་ཡོདཔ་སྦེ་མཐོང་ནུག གནས་སྡུད་འདི་ཚུ་གིས་ མི་གི་ཀེན་སར་ནང་ལུ་ TMEགིས་ Tཁམས་ཕྲན་གྱི་བཅུད་འགྱུར་ལུ་ ག་དེ་སྦེ་གནོད་དོ་ག་ལུ་ ཕན་གནོད་ཡོདཔ་ཨིན། Tཁམས་ཕྲན་དང་ཀེན་སར་གྱི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་བར་ན་ འཚོ་བཅུད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཐད་ཀར་དུ་དོ་འགྲན་ཡོདཔ་སྦེ་སྙན་ཞུ་འབད་དེ་ཡོད་རུང་ རྫས་སྦྱོར་འདི་གིས་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་འཕེལ་འགྱུར་དང་ ནད་ཐུབ་ཀྱི་ལན་ལོག་ཚུ་ མར་ཕབ་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཐད་ཀར་དུ་ ཚད་འཛིན་འབད་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས། འ་ནི་བཅུད་གྱུར་གྱི་ལཱ་འགན་འདི་ ཁ་གསལ་སྦེ་བཤད་མི་འདི་གིས་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་ནད་བཀག་ཐབས་ལུ་ ཐབས་ཤེས་གཞན་མི་ཅིག་བཏོན་ཚུགས་ནི་ཨིན་མས།
ནདཔ་གི་དཔེ་ཚད་དང་སྨན་བཅོས་གནས་སྡུད་ཚུ་ ཀེ་ནེ་གྲའི་ ཀྲི་ཤུ་ མཛོད་ཁང་ཡོངས་འབྲེལ་གྱིས་ ངོས་ལེན་འབད་མི་ བི་སི་ ཀེན་སར་གྱི་ ཀྲི་ཤུ་ ཀྲི་ཤུ་ མཛོད་ཁང་བརྒྱུད་དེ་ ཐོབ་ཡོདཔ་ཨིན་པས། བི་སི་ ཀེན་སར་ཞིབ་འཚོལ་གྱི་ ཀུན་སྤྱོད་ཚོགས་ཆུང་དང་ བིརི་ཊིཤ་ཀོ་ལོམ་བི་ཡ་གཙུག་ལག་སློབ་སྡེ་ (H07-00463) གིས་ ཆ་འཇོག་འབད་མི་ མཐུན་གྲོས་དང་འཁྲིལ་ ནདཔ་ཚུ་གི་དཔེ་ཚད་དང་ སྨན་བཅོས་གནས་སྡུད་ཚུ་ག་ར་ ཡིག་ཐོག་གི་ གནང་བ་ཐོབ་ཡོདཔ་མ་ཚད་ གཞུང་འབྲེལ་དུ་ གནང་བ་ བཀག་ཆ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན་པས། དཔེ་ཚད་ཚུ་ ངོས་ལེན་ཡོད་པའི་ བའི་ཨོ་བེངཀ་ (BRC-00290) ནང་ གསོག་འཇོག་འབད་དེ་ཡོདཔ་ཨིན། ནད་པའི་ཁྱད་ཆོས་ཁ་གསལ་གྱི་ཐིག་ཁྲམ་S1 དང་S5 ནང་སྟོན་ཡོད། བསིལ་དྲོད་ཉམས་སྲུང་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ནདཔ་གི་རྨེན་བུ་གི་དཔེ་ཚད་འདི་ འཕྲུལ་རིག་གི་ཐོག་ལས་ བཤིག་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་གཅིག་གི་ བསྒུགས་བཞག་ཐབས་ལུ་ མའི་ཀྲོན་༡༠༠གི་ཚགས་མ་བརྒྱུད་དེ་ བསྐུལ་བཏང་ནི་གི་དོན་ལས་ མཆིནམ་འདི་ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། ནདཔ་གི་ཆུ་བཤལ་འདི་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཕྱེམ་ལ་བཟོ་སྟེ་ ཆུ་བཤལ་འདི་ བཏོན་བཏང་ནི་གི་དོན་ལས་ དྲོད་ཚད་༤ ལུ་ སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ ༡༥༠༠ rpm ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། རྨེན་བུ་དང་ མཆིནམ་ལས་ཐོབ་མི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ བརྒྱ་ཆ་༥༠ དྲོད་ཤུགས་མེད་པའི་ མི་གི་ཨེ་བི་ཁྲག་རྒྱུན་ ༼སིག་མ་ཨཱལ་ཌི་རིཆ་༽ དང་ བརྒྱ་ཆ་༤༠ ཨར་པི་ཨེམ་ཨའི་-༡༦༤༠ ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག༽ དེ་ལས་ བརྒྱ་ཆ་༡༠ ཌའི་མི་ཐཱལ་སཱལ་ཕོ་ཨོག་སའིཌ་ཚུ་ནང་ བཀག་བཞག་ཡོདཔ་ཨིན། འ་ནི་ཉམས་སྲུང་འབད་དེ་ཡོད་མི་ཁམས་ཕྲན་རྐྱངམ་ཅིག་འདི་ བཞུ་ཞིནམ་ལས་ གཤམ་གསལ་བཀོད་དེ་ཡོད་མི་ བཅུད་འགྱུར་རིག་པ་དང་ བཅུད་འགྱུར་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ནུག
བརྒྱུད་ལམ་ཆ་ཚང་ནང་ ༠.༢༢ μm ཚགས་མ་ ༥༠:༥༠ ལྷན་ཐབས་ RPMI ༡༦༤༠: AimV ཡོད། RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Syentific) 10% དྲོད་ཚད་མེད་པའི་མིའི་ AB ཁྲག་རྒྱུན་ (Sigma-Aldrich) དང་ 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Syentific) དང་། ཨིསི་ཊེབ་ཊོ་མའི་སིན་ (PenStrep) ཐབས་ཤེས་ (ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག་) དང་ ༥༠ μMB-མར་ཀེབ་ཊོ་ཨི་ཐ་ནོལ། AimV (Invitrogen) འདི་ ༢༠ mM Hepes (ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག) དང་ ༢ mM l-glutamine (ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག) གིས་ ལྷན་ཐབས་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཕོལོ་སའི་ཀྲོ་མི་ཀྲར་གྱི་ཚོས་གཞི་འདི་ ༠.༢༢μm ཚགས་མ་ཕོསི་ཕེཊ་བཱ་ཕར་གྱི་ཚྭ་ཆུ་ (PBS; Invitrogen) དང་ བརྒྱ་ཆ་༣ དྲོད་ཤུགས་མེད་པའི་ AB མི་གི་ཁྲག་རྒྱུན་ (Sigma) གིས་ ལྷན་ཐབས་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་བར་སྟོང་འདི་ ༠.༢༢μm ཚགས་མ་བཏང་མི་ PBS དང་ ༠.༥% དྲོད་ཤུགས་མེད་པའི་མི་ AB ཁྲག་རྒྱུན་ (Sigma-Aldrich) གིས་ ལྷན་ཐབས་འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
༣༧°C གི་བརྒྱུད་ལམ་ཆ་ཚང་ནང་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ སྐར་མ་༣༠ གི་རིང་ལུ་ ༡༠ nM MT DR དང་ ༡༠༠ μM ༢-NBDG གི་ཐོག་ལས་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། འདི་གི་ཤུལ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ དྲོད་ཚད་༤གི་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༥གི་རིང་ལུ་ ཚོས་གཞི་ eF506གི་ཐོག་ལས་ ཚོས་གཞི་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ FC Block ༼eBioscience༽ དང་ Brilliant Stain Buffer ༼BD Biosciences༽ ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་རང་ བཀག་བཞག་སྟེ་ ཕོལོ་སའི་ཀྲོ་མི་ཀྲར་གྱི་ ཚོས་གཞི་བཱ་ཕར་ནང་ལུ་ བཞུ་བཅུག་སྟེ་ ༼བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་གི་བཀོད་རྒྱ་དང་འཁྲིལ་༽ དེ་ལས་ ཁང་མིག་གི་དྲོད་ཚད་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ བཙུགས་དགོ། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ནུས་གཟུགས་ཆ་ཚང་ཅིག་དང་གཅིག་ཁར་ ༼ཐིག་ཁྲམ་S2༽ དྲོད་ཚད་༤°C ལུ་ སྐར་མ་༢༠གི་རིང་ལུ་ ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཀྲི་ ཚོས་གཞི་བཏང་ནི་གི་བཱ་ཕར་ནང་ལུ་ ཚོས་གཞི་བཏང་དགོ། དབྱེ་དཔྱད་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཊི་རི་ ཚོས་གཞི་བཏང་མི་ བཱ་ཕར་ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R རིམ་སྒྲིག) ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་རང་ བཀག་བཞག། ནང་ཐིག་གྱངས་ཁ་གནད་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་ལུ་ SpectroFlo དང་ FlowJo V10 ལག་ལེན་འཐབ། གནད་སྡུད་གསར་བསྐྲུན་འབད་ནི་ལུ་ GraphPad Prism 8 ལག་ལེན་འཐབ། 2-NBDG དང་ MT DR གི་ འོད་མདངས་ཤུགས་ཚད་ (MFI) འདི་ log-normalized འབད་ཡོདཔ་དང་ དེ་ལས་ མཐུན་སྒྲིག་འབད་མི་ནདཔ་ཚུ་རྩིས་ཁྲ་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལས་ རྩིས་དཔྱད་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལས་ t བརྟག་དཔྱད་འདི་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། དབྱེ་དཔྱད་ལས་ བྱུང་ལས་༤༠ ལས་ཉུང་བའི་མི་རློབས་ཆ་མཉམ་བཏོན་གཏང་། རྩིས་དཔྱད་དབྱེ་དཔྱད་དང་ གནད་སྡུད་མཐོང་སྣང་ཚུ་ མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ ལོག་པའི་གནས་གོང་གང་རུང་ཅིག་གི་དོན་ལུ་ ཨེམ་ཨེཕ་ཨའི་གནས་གོང་ ༡ བཙུགས།
གོང་འཁོད་བྱ་རིམ་གྱི་པེ་ནཱལ་གྱི་ལག་ཐོག་སྒོ་སྒྲིག་ཐབས་ཤེས་འདི་ ལྷན་ཐབས་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཕོལོ་ཇོ་ནང་ ཁམས་ཕྲན་ཤི་མི་ཚུ་ རྩ་མེད་བཏང་པའི་ཤུལ་ལས་ རང་བཞིན་གྱིས་ མི་རློབས་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ འགན་སྤྲོད་འབད་ནི་ལུ་ དབྱིབས་བཀག་ཆ་ཤིང་ (FAUST) (༢༡) གིས་ མཆན་འགྲེལ་ཆ་ཚང་ལག་ལེན་འཐབ་ཅི། ང་བཅས་ཀྱིས་ མི་རློབས་ཚུ་ བགོ་བཀྲམ་མ་འབད་བར་ཡོད་མི་ཚུ་ མཉམ་སྡེབ་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཐོན་འབྲས་འདི་ ལག་ཐོག་ལས་ འཛིན་སྐྱོང་འཐབ་ཨིན། དཔེ་ཚད་རེ་ལུ་ སྤྱིར་སྙོམས་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་བརྒྱ་ཆ་༢ལྷགཔ་ཅིག་ཡོདཔ་ད་ བསྡོམས་ཀྱིས་མི་རློབས་༡༡ཡོདཔ་ཨིན།
ཕི་ཀོལ་གྱེན་ཐིག་མཐུག་ཚད་ཀྱི་དབུགས་གཏོང་ལེན་འདི་ ཁྲག་ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་གི་ཐོན་སྐྱེད་ལས་ PBMC དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་གི་དོན་ལས་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ༼STEMCELL Technologies༽ CD8 + T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ CD8 MicroBeads (Miltenyi) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ PBMC ལས་སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ཞིནམ་ལས་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་ཚུ་གི་བཀོད་རྒྱ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ བདུན་ཕྲག་༢ ཀྱི་རིང་ TransAct (Miltenyi) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བརྒྱུད་ལམ་ཆ་ཚང་ནང་ རྒྱ་སྐྱེད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ཡོད་པའི་ བརྒྱུད་ལམ་ཆ་ཚང་ནང་ ཉིནམ་༥ གི་རིང་ལུ་ བཞག་ཞིནམ་ལས་ དེ་ལས་ TransAct གི་ཐོག་ལས་ ལོག་སྟེ་ར་ སེམས་ཤུགས་བྱིན་ཡོདཔ་ཨིན། ཉིནམ་༧ པའི་ནང་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་གིས་ བཀོད་རྒྱ་དང་འཁྲིལ་ མི་གི་ CD45 MicroBeads (Miltenyi) འདི་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ འཕྲོ་མཐུད་དེ་ སྐོར་ཐེངས་གསུམ་ནང་ མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནིའི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན་པས། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ flow cytometry དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ༼གོང་ལས་བཤད་དོ་བཟུམ་སྦེ་༽ ཁམས་ཕྲན་ས་ཡ་གཅིག་འདི་ LC-MS/MS དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཚར་གསུམ་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་ཚུ་ གཤམ་གསལ་ལྟར་ LC-MS/MS གིས་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ང་བཅས་ཀྱིས་ གློག་རྡུལ་གྱངས་ཁ་༡༠༠༠ དང་གཅིག་ཁར་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་གོང་མེདཔ་སྦེ་ ཚོད་རྩིས་བཏོན་ཡི། དཔེ་ཚད་རེ་རེ་བཞིན་དུ་ གློག་རྡུལ་ཨང་གྲངས་ཡོངས་བསྡོམས་ (TIC) གིས་ སྤྱིར་བཏང་བཟོཝ་ཨིནམ་དང་ དབྱེ་དཔྱད་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་ ལོ་གཱ་རི་དམ་གྱི་ཐོག་ལས་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་དེ་ རང་བཞིན་གྱིས་ MetaboAnalystR ནང་ལུ་ སྤྱིར་བཏང་བཟོཝ་ཨིན།
ནདཔ་རེ་རེ་གི་ཁམས་ཕྲན་གཅིག་གི་ བསྒུགས་བཞག་མི་འདི་ བཞུ་ཞིནམ་ལས་ ༤༠ μm གི་ཚགས་མ་བརྒྱུད་དེ་ བརྒྱུད་ལམ་ཆ་ཚང་ནང་ལུ་ ཚགས་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། ༼གོང་ལུ་བཀོད་དོ་བཟུམ་སྦེ་༽ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་ཚུ་གི་མཐུན་གྲོས་དང་འཁྲིལ་བ་ཅིན་ CD8+ དང་ CD4+ དེ་ལས་ CD45- ཁམས་ཕྲན་ཚུ་གི་དཔེ་ཚད་ཚུ་ མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལས་ MicroBeads (Miltenyi) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ མེག་ནི་ཊིག་བིཌ་དབྱེ་བ་ཕྱེ་སྟེ་ རིམ་པ་གསུམ་གྱི་ གདམ་ཁ་ལེགས་ཤོམ་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན། མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཁམས་ཕྲན་མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་བར་སྟོང་ནང་ ལོག་སྟེ་རང་ བཀག་བཞག་སྟེ་ རྩིས་རྐྱབ་ཨིན། ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ མི་གི་སི་ཌི་༨ ཕྱེངམ་དང་ མི་གི་སི་ཌི་༤ ཕྱེངམ་ ཡང་ན་ མི་གི་སི་ཌི་༤༥ ཕྱེངམ་ ༼མིལ་ཀྲེ་ནི་༽ ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ དྲོད་ཚད་༤གི་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༥གི་རིང་ལུ་ འཕྱེལ་འགྱོ་ཞིནམ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་བཱ་ཕར་གྱིས་ བཀྲུ་དགོཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་འདི་ LS ཀེར་ཐིག་ (Miltenyi) བརྒྱུད་དེ་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ངེས་གཏན་དང་ ངེས་གཏན་མེད་པའི་དཔྱ་རྩིས་ཚུ་བསྡུ་ལེན་འབདཝ་ཨིན། དུས་ཡུན་མར་ཕབ་འབད་དེ་ ཁམས་ཕྲན་སླར་གསོའི་གོ་རིམ་འདི་ ཡར་སེང་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ CD8-fraction འདི་ CD4+ མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིནམ་ད་ CD4-fraction འདི་ ཤུལ་ལས་ CD45-མཐོ་དྲགས་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། ཐབས་ཤེས་འདི་ ཁ་ཕྱེ་ནིའི་བྱ་རིམ་ཆ་མཉམ་ནང་ འཁྱེག་གུ་བཞག།
བཅུད་གྱུར་གྱི་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དཔེ་ཚད་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ འཁྱེག་གི་ཚྭ་གི་ཐབས་ཤེས་ཅིག་གིས་ ཚར་གཅིག་བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ དཔེ་ཚད་རེ་ལུ་ མི་ཐ་ནོལ་བརྒྱ་ཆ་༨༠འབད་མི་ མི་ལི་ཀྲར་༡རེ་བླུགས་ཞིནམ་ལས་ འཁྱེག་བཏང་ཞིནམ་ལས་ ཁུ་བ་གི་ནང་ལུ་ འཁྱེག་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་ཚུ་ གྱང་ཤུགས་ཅན་གྱི་འཁོར་རིམ་གསུམ་གྱི་ནང་ལུ་བཙུགས་ཏེ་ དྲོད་ཚད་༤གི་ནང་ལུ་ སྐར་མ་༡༥གི་རིང་ལུ་ ༡༤༠༠༠ rpm ལུ་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཡོད་པའི་ ཆུ་འདི་སྐམ་མ་ཚུགས་ཚུན་ཚོད་ རླངས་གྱུར་འགྱོཝ་ཨིན། བཅུད་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་ བརྒྱ་ཆ་༠.༠༣གི་ ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་གི་ ༥༠ μl ནང་ལུ་ ལོག་སྟེ་བཞུ་ཞིནམ་ལས་ སླ་བསྲེ་རྐྱབ་ཞིནམ་ལས་ བརྡུངས་རྫས་ཚུ་བཏོན་བཏང་ནི་གི་དོན་ལས་ དབུགས་གཏོང་ལེན་འབདཝ་ཨིན།
གོང་དུ་བཤད་པ་ལྟར་རྫས་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་བཏོན་དགོ། བཅུད་འགྱུར་རིག་པའི་ཞིབ་འཚོལ་གྱི་དོན་ལས་ ཆུ་བཏོན་མི་འདི་ ལཱ་འབད་ཚུགས་པའི་ ཁུ་བ་གི་ཚོས་གཞི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ དམ་སྦྱིས་ནང་ལུ་ སྤོ་བཤུད་འབད། བེཆ་གནོད་པ་ཚུ་བཀག་ཐབས་ལུ་ དཔེ་ཚད་རེ་རེ་ལུ་ ནང་ཐིག་གྱངས་ཁ་ཅོག་འཐདཔ་སྦེ་ སྨན་བཅོས་འབད་ནི་ལུ་ གང་བྱུང་སྨན་བཅོས་མཐུན་འབྲེལ་ལག་ལེན་འཐབ། ང་བཅས་ཀྱིས་ ཧེ་མ་ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ནང་ལུ་ དཔར་བསྐྲུན་འབད་མི་ འཛམ་གླིང་ཡོངས་ཁྱབ་ཀྱི་ རྫས་སྦྱོར་གྱི་ སྤུས་ཚད་བརྟག་དཔྱད་འབད་ཡི། Chromatographic དབྱེ་དཔྱད་དང་ མཐོ་ཚད་ས་ཁོངས་མཉམ་བསྡོམས་འདི་ MultiQuant ཐོན་རིམ་ ༢.༡ མཉེན་ཆས་ (Applied Biosystems SCIEX) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
བཅུད་འགྱུར་གྱི་གནས་གོང་མེད་མི་འདི་ ཚད་རྩིས་བཏོན་ནི་གི་དོན་ལས་ གློག་རྡུལ་གྱངས་ཁ་༡༠༠༠ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་དང་ དཔེ་ཚད་བཟོ་སྦྱོར་ལས་ ལག་ཆས་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་ཐོག་ལས་ འགྱུར་བ་ཚུ་ བཅོ་ཁ་རྐྱབ་ནི་གི་དོན་ལས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་མི་ བཅུད་འགྱུར་རེ་རེ་གི་ སྤྱིར་བཏང་གི་ས་སྒོ་རྩིས་རྐྱབ་ནི་གི་དོན་ལས་ དཔེ་ཚད་རེ་རེ་གི་ TIC ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཊི་ཨའི་སི་ སྤྱིར་བཏང་བཟོ་བའི་ཤུལ་ལས་ མེ་ཊོ་ཨེ་ནཱལ་སིཊི་ཨར་(༥༡) (སྔོན་སྒྲིག་ཚད་བཟུང་) འདི་ ལོ་གཱ་རི་དམ་གཞི་བསྒྱུར་དང་ རང་བཞིན་ཚད་གཞི་གྲལ་ཐིག་ཚད་འཇལ་གྱི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། དཔེ་ཚད་ཀྱི་དབྱེ་བ་ཚུ་གི་བར་ན་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་འཚོལ་ཞིབ་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ང་བཅས་ཀྱིས་ vegan R ཐུམ་སྒྲིལ་དང་གཅིག་ཁར་ PCA ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་དང་ ནདཔ་ཚུ་དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ཆ་ཤས་ཅིག་ མ་ལང་པའི་དབྱེ་དཔྱད་ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་ཚུ་གི་བར་ན་ ཨིའུ་ཀི་ལི་ཌིའན་ཐག་རིང་ཚད་འདི་ བསྡུ་སྒྲིག་འབད་ནི་ལུ་ དྲོད་སབ་ཁྲ་ཌེན་ཌོ་གཱརམ་བཟོ་བསྐྲུན་འབད་ནི་ལུ་ ཝརཌི་ཐབས་ལམ་ལག་ལེན་འཐབ། ང་བཅས་ཀྱིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་དང་ མཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་ཚུ་ནང་ལུ་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་ངོས་འཛིན་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ གནས་ཚད་དང་ལྡན་པའི་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཚད་གཞི་ལུ་ limma(༥༢)ལག་ལེན་འཐབ་ནུག འགྲེལ་བཤད་འཇམ་ཏོང་ཏོ་བཟོ་ནི་གི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ དཔེ་ཚད་གསལ་བཀོད་འབད་ནི་ལུ་ སྡེ་ཚན་གྱི་སྤྱིར་སྙོམས་ཚད་གཞི་འདི་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ མཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་ནང་ ཁམས་ཕྲན་དབྱེ་བ་ཚུ་ སྡེ་ཚན་རེ་རེ་བཞིན་དུ་ བརྩི་འཇོག་འབདཝ་ཨིན། (n = 6 groups); འདི་ཡང་ བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ བཅུད་འགྱུར་རེ་རེ་གི་དོན་ལུ་ བསྐྱར་ལོག་འཇལ་ཚད་གསུམ་འབད་ཡི། ནདཔ་སོ་སོ་ཚུ་གི་བར་ན་ བཅུད་འགྱུར་གྱི་ཁྱད་པར་བརྟག་དཔྱད་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ནདཔ་ཚུ་རྩིས་ཏེ་ ལི་མ་དཔེ་ཚད་འདི་ གཏན་འཁེལ་གྱི་ཐོག་ལས་ བདེ་སྒྲིག་འབད་ཡི། ང་བཅས་ཀྱིས་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་དབྱེ་བ་དང་ Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction) གི་མཐའ་འཁོར་ཆུང་བ་གི་བར་ན་ སྔོན་སྒྲིག་འབད་ཡོད་པའི་ཁྱད་པར་གྱི་ གལ་གནད་འདི་སྙན་ཞུ་འབདཝ་ཨིན།
Miltenyi Dead Cell Removal Kit ༼>80% viability༽ ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ ནུས་ཤུགས་ཡར་དྲག་བཏང་པའི་ཤུལ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་གཅིག་གི་ ཡིག་བསྒྱུར་གྱི་གོ་རིམ་འདི་ 10x 5′gene expression protocol ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ བསྡོམས་ཀྱིས་ འཁྱགས་བཞག་མི་ ascites དང་ ཀྲིའུ་མར་གྱི་དཔེ་ཚད་ཚུ་གུར་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། མཐུན་སྒྲིག་འབད་མི་ རྨེན་བུ་དང་ མཆིནམ་གྱི་ནད་གཞི་ཡོད་མི་ གནད་དོན་༥ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན་རུང་ རྨེན་བུ་གི་དཔེ་ཚད་གཅིག་ལས་ འཚོ་ཐབས་དམའ་ཤོས་ཡོད་མི་འདི་གིས་ འདི་ཚུ་ བཙུགས་མ་ཚུགསཔ་ཨིན་མས། ནདཔ་གདམ་ཁ་ལེ་ཤ་ཐོབ་ཐབས་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ནདཔ་རེ་རེ་གི་དཔེ་ཚད་ཚུ་ ༡༠x ཀོརོ་མིཡམ་ཚད་འཛིན་གྱི་ ལམ་ཚུ་ནང་ མཉམ་སྡེབ་འབད་དེ་ མཆིནམ་དང་ རྨེན་བུ་གི་ས་སྒོ་ཚུ་ སོ་སོ་སྦེ་ དབྱེ་དཔྱད་འབད་ཡི། གོ་རིམ་སྒྲིག་པའི་རྗེས་སུ་ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ཆ་སྒྲིག་མཇུག་ (PE), ཀིའུ་བེག་རིགས་མཚན་; འདོན་སྤེལ།: ༢༠༡༡/༠༤/༢༠ རིག་པ།(༥༣) ང་ཚོས་CellSNP དང་ Vireo (53) ལག་ལེན་འཐབ་ཡོད། འདོན་སྤེལ།: ༢༠༡༠/༠༣/༠༣ རིག་པ།(༥) འདི་ཡང་ གཟའ་ཉི་མའི་ཉིན། དབྱེ་དཔྱད་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ཁམས་ཕྲན་༦༩༧༥ཐོན་ཡོདཔ་ཨིན། t-SNE དང་ཅིག་ཁར་ མཐོང་སྣང་བྱུང་མི་འདི་ CD8A དང་ GZMA གི་བརྡ་སྟོན་གྱིས་ གསལ་བཀོད་འབད་དེ་ཡོདཔ་ད་ འདི་ཡང་ Izar et al (16) གིས་ དཔར་བསྐྲུན་འབད་ཡོད་པའི་གནས་སྡུད་ཚུ་ ཐོབ་ཚུགས་དོ་ཡོདཔ་ཨིན་མས།
PBMC འདི་ ཁྲག་ཁམས་ཕྲན་ཁ་ཕྱེ་ནི་གི་ཐོན་སྐྱེད་ལས་ ༼STEMCELL Technologies༽ ཕི་ཀོལ་གྱི་གྱེན་ཐིག་མཐུག་ཚད་ཀྱི་ དབུགས་གཏོང་ལེན་གྱི་ཐོག་ལས་ ཁ་ཕྱེ་ཡོདཔ་ཨིན། CD3 + ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ CD3 ཕྱེད་ཀ་ (Miltenyi) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ PBMC ལས་སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། MNA ཡོད་མེད་ཀྱི་སྐབས་ལུ་ CD3+ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ CD3 (5μg/ml) དང་ བཞུ་ཚུགས་པའི་ CD28 (3μg/ml) དེ་ལས་ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ཤུགས་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། རྒྱ་སྐྱེད་ཀྱི་ཉིནམ་མཇུག་ལུ་ འཚོ་ཐབས་(Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) དང་ ཁྱབ་སྤེལ་(123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ཚུ་ ཕོལོ་སའི་ཀྲོ་མི་ཀྲི་གི་ཐོག་ལས་ དབྱེ་ཞིབ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཆུ་ཚོད་༤ གི་རིང་ལུ་ GolgiStop དང་ཅིག་ཁར་ PMA (20 ng/ml) དང་ ionomycin (1μg/ml) གི་ཐོག་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་དེ་ ནུས་པ་ཅན་གྱི་ལཱ་འགན་ཚུ་ བརྟག་དཔྱད་འབད་དེ་ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend) དང་ CD4-AF700 (RPA-T4) དེ་ལས་ TNF (ཨེམ་ཨེ་བི་༡༡, བིཌི)། qPCR དང་ ChIP ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ PMA (20 ng/ml) དང་ ionomycin (1μg/ml) གིས་ཆུ་ཚོད་ ༤ གི་རིང་ལུ་ སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་དགོ། ELISA supernatant འདི་ PMA (20 ng/ml) དང་ ionomycin (1 μg/ml) གཉིས་ཀྱིས་ ཆུ་ཚོད་༤ གི་རིང་ལུ་ སྐུལ་མ་མ་འབད་བའི་ཧེ་མ་དང་ ཤུལ་ལས་ བསྡུ་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ RNA སོ་སོ་སྦེ་བཞག་ནིའི་དོན་ལུ་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་གི་མཐུན་སྒྲིག་ལུ་གནས་དགོ། དཔེ་ཚད་འདི་ གཅིག་མཚུངས་བཟོ་ནི་ལུ་ QIAshredder (QIAGEN) ལག་ལེན་འཐབ། ལྷན་ཐབས་ཀྱི་ཌི་ཨེན་ཨེ་ (སི་ཌི་ཨེན་ཨེ་) མཉམ་སྦྱོར་འབད་ནི་གི་དོན་ལུ་ ལྕོགས་གྲུབ་མཐོ་བའི་ཨར་ཨེན་ཨེ་ལས་ སི་ཌི་ཨེན་ཨེ་ཅ་ཆས་ (ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག་) ལག་ལེན་འཐབ། རིགས་མཚན་གྱི་བརྡ་སྟོན་འདི་ ༼བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་གི་མཐུན་གྲོས་དང་འཁྲིལ་ཏེ་༽ གཤམ་གསལ་གྱི་འཚོལ་ཞིབ་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ཊག་མཱན་མགྱོགས་དྲགས་ཡར་འཕེལ་ཅན་གྱི་མསི་ཊར་མིགསི་ (ཐར་མོ་ཕི་ཤར་ཚན་རིག་) ལག་ལེན་འཐབ། Hs02786624_g1 [གྷི་ལི་སི་རཱལ་ཌི་ཧའི་ཌི་-༣-ཕོསི་ཕེཊ་ཨོཕ་ཧའི་ཌོ་ཇེན་ (GAPDH)] དང་ Hs01010726_m1 (SLC22A2) བཅས་ཡིན། དཔེ་ཚད་ཚུ་ མའི་ཀོརོ་ཨེམ་པི་མགྱོགས་དྲགས་འོད་ཀྱི་ ༩༦-ཝེལ་ལན་ལོག་ཤོག་ལེབ་ ༼འཇུག་སྤྱོད་སྐྱེ་ལྡན་རིམ་ལུགས༽ ནང་ལུ་ ཨིསི་ཀྲེཔ་ཝན་པཱལསི་ དུས་ཚོད་ངོ་མའི་ པི་སི་ཨར་ལམ་ལུགས་ ༼འཇུག་སྤྱོད་སྐྱེ་ལྡན་རིམ་ལུགས༽ ༼འཇུག་སྤྱོད་སྐྱེ་ལྡན་རིམ་ལུགས༽ གུ་ལུ་ མའི་ཀོརོ་ཨེམ་པི་འོད་ཀྱི་གློག་བརྙན་དང་གཅིག་ཁར་ གཡོག་བཀོལ་ཡོདཔ་ཨིན། ༣༥ ལས་ལྷག་སྟེ་ཡོད་མི་ སི་ཊི་གནས་གོང་གང་རུང་ཅིག་ བརྟག་དཔྱད་ཚད་གཞི་ལས་ལྷག་སྟེ་ཡོདཔ་སྦེ་ བརྩི་འཇོག་འབདཝ་ཨིནམ་དང་ བརྟག་དཔྱད་མ་འབད་བར་རྟགས་བཀལ་ཡོདཔ་ཨིན།
ཧེ་མ་གསལ་བཀོད་འབད་ཡོད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ ཆི་པི་འབད།(༥༨) མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཕོར་མལ་ཌི་ཧའིཌ་ (མཐའ་མའི་ཚད་གཞི་༡.༤༢%) གིས་ སྨན་བཅོས་འབད་དེ་ ཁང་མིག་དྲོད་ཚད་ནང་ སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ བཀག་བཞག་ནུག། སྐར་མ་༡༠ གི་རིང་ལུ་ འཁྱེག་གུ་ལུ་ ལྷན་ཐབས་འབད་མི་ ཕོཝ་རྒྱགས་མི་ བཱ་ཕར་ (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl and 0.1% NP-40) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ དེ་ལས་ འགྲེལ་བཤད་རྐྱབ་ཡོད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ ནད་འབུབ་བཀག་ཐབས་ནང་ ལོག་སྟེ་རང་ བཀག་བཞག་དགོ། (58 ) དེ་ལས་ དཔེ་ཚད་འདི་ གཤམ་གསལ་གྱི་འཁོར་རིམ་ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ སྒྲ་སྐད་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་ནང་ལུ་ shaCC4°4night དང་ཅིག་ཁར་ ChIP-grade immunoglobulin G ༼ཁམས་ཕྲན་བརྡ་སྟོན་འཕྲུལ་རིག་ ༡μl༽ དང་ histone H3 ༼ཁམས་ཕྲན་བརྡ་སྟོན་འཕྲུལ་རིག་ ༣μl༽ NFAT ༼Invitrogen ༣μl༽ དེ་ལས་ SP1 ༼ཁམས་ཕྲན་བརྡ་སྟོན་འཕྲུལ་རིག་ ༣μl༽ ནུས་གཟུགས་ཚུ་ བཙུགས་དགོ། འཚོ་བཅུད་ཨེ་གི་ཕྱེངམ་འདི་ ༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་མཚོན་རིག་༽ དཔེ་ཚད་འདི་ དྲོད་ཚད་༤གི་ནང་ལུ་ ཆུ་ཚོད་༡གི་རིང་ལུ་ དྲག་པོ་སྦེ་བསྒུལ་ཞིནམ་ལས་ དྲི་ཨེན་ཨེ་འདི་ཡར་དྲག་བཏང་ནི་གི་དོན་ལས་ ཅེ་ལེགསི་ཕྱེངམ་འདི་ལག་ལེན་འཐབ་ཞིནམ་ལས་ འཚོ་བཅུད་བཞུ་ནི་གི་དོན་ལས་ འཚོ་བཅུད་ཀེ་༼ཐར་མོ་ཕི་ཤར་༽ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། TNFα ཁྱབ་སྤེལ་འབད་མི་འདི་ PCR གིས་ བརྟག་དཔྱད་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། དེ་ལས་ལྡོག་ཕྱོགས་ལུ་ ཇི་ཊི་ཇི་སི་སི་ཨེ་ཨེ་སི་ཨེ་ཨེ་སི་ཊི་ཇི་སི་སི་ཊི་ཊི་ཨེ་ཊ་ཊི་ཇི་ (207-bp ཐོན་རྫས)། པར་ཚུ་ Image Lab (Bio-Rad) གིས་བཟོ་སྟེ་ ImageJ མཉེན་ཆས་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབོར་ཚད་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན།
ཁམས་ཕྲན་ལམ་སྲོལ་གྱི་ཆུ་འདི་ གོང་ལས་བཤད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ བསྡུ་ལེན་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། གཏན་འབེབས་འདི་ཡང་ མི་གི་TNFα ELISA kit (Invitrogen) དང་ མི་ཡི་IL-2 ELISA kit (Invitrogen) དེ་ལས་ མི་ཡི་IFN-γ ELISA kit (Abcam) ཚུ་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་ཚུ་གི་བྱ་རིམ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན། བཟོ་སྐྲུན་འབད་མི་ཚུ་གི་སྒྲིག་གཞི་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ ཆུ་བཏོན་མི་འདི་ TNFα དང་ IL-2 བརྟག་དཔྱད་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ༡:༡༠༠ དང་ IFN-γ བརྟག་དཔྱད་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ ༡:༣ བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། ༤༥༠ ཨེན་ཨེམ་ལུ་ དབང་པོ་འཇལ་ནིའི་དོན་ལུ་ ཨེན་ཝི་ཛིན་ ༢༡༠༤ སྣ་མང་ཁ་ཡིག་ལྷག་མི་ (PerkinElmer) ལག་ལེན་འཐབ།
PBMC འདི་ ཁྲག་ཁམས་ཕྲན་ཁ་ཕྱེ་ནི་གི་ཐོན་སྐྱེད་ལས་ ༼STEMCELL Technologies༽ ཕི་ཀོལ་གྱི་གྱེན་ཐིག་མཐུག་ཚད་ཀྱི་ དབུགས་གཏོང་ལེན་གྱི་ཐོག་ལས་ ཁ་ཕྱེ་ཡོདཔ་ཨིན། CD3 + ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ CD3 ཕྱེད་ཀ་ (Miltenyi) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ PBMC ལས་སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། MNA ཡོད་མེད་དང་མེད་པའི་སྐབས་ CD3+ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཉིནམ་༣ གྱི་རིང་ལུ་ CD3 (5μg/ml) དང་ བཞུ་ཚུགས་པའི་ CD28 (3μg/ml) དེ་ལས་ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ཚུ་དང་གཅིག་ཁར་ ལཱ་འབད་བཅུག་ནུག། ཉིནམ་༣ གྱི་ཤུལ་ལས་ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་བསྡུ་བསྒྱོམ་འབད་དེ་ བརྒྱ་ཆ་༠.༩ གི་ཚྭ་ཆུ་གིས་ བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ ཕྱེམ་ལ་འདི་ མགྱོགས་དྲགས་སྦེ་ གྱང་ཤུགས་ཅན་སྦེ་ བཞག་ནུག། ཁམས་ཕྲན་གྱངས་ཁ་འདི་ ཕོལོ་སའི་ཊོ་མི་ཊི་རི་ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R རིམ་སྒྲིག) གིས་ 123count eBeads ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
གོང་དུ་བཤད་པ་ལྟར་རྫས་འགྱུར་གྱི་རྫས་སྦྱོར་ཚུ་བཏོན་དགོ། སྐམ་པའི་བཏོན་ཐངས་འདི་ ཁམས་ཕྲན་འདྲ་མཉམ་/μl ༤༠༠༠ གི་ཚད་གཞི་ནང་ བསྐྱར་བཟོ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་འདི་ ཕྱི་འགྱུར་གྱི་གནས་རིམ་གྱི་ ཚོས་གཞི་བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་ཐོག་ལས་ དབྱེ་དཔྱད་འབད། ༼༡༢༩༠ མཐའ་མེད་༢ པ་ ཨེ་ཇི་ལེནཊ་འཕྲུལ་རིག་ སཱན་ཊ་ཀ་ལ་ར་ སི་ཨེ་༽ དང་ ཀོར་ཊེགསི་ཀྲི་༣ ཀ་ཆེན་ ༼༢.༡×༡༥༠ ཨེམ་ཨེམ་ རྡུལ་ཕྲན་གྱི་ཚད་ ༡.༦-μm དང་ རྡུལ་ཕྲན་གྱི་ཚད་ ༡༢༠-Å; #༡༨༦༠༠༨༥༠,༽ པོ་ལར་མཱསི་ཨིསི་པེག་ཀྲོ་མི་ཀྲར་ ༼༦༤༧༠ ཨེ་ཇི་ལེནཀྲ༽ འདི་ནང་ལུ་ ཨེ་ལིག་ཀྲོ་ཨིསི་པེརེ་གློག་བསྒྱུར་འདི་ ངེས་གཏན་གྱི་ཐབས་ལམ་ནང་ལུ་ལཱ་འབདཝ་ཨིན། འགྲུལ་འཕྲིན་གྱི་གནས་རིམ་ཀ་འདི་ ༠.༡% ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་ (H2O ནང་) འགྲུལ་འཕྲིན་གྱི་གནས་རིམ་ཁ་འདི་ ༩༠% ཨེ་སི་ཊོ་ནི་ཊི་རལ་ ༠.༡% ཕོར་མིག་ཨེ་སིཌ་ཨིན། LC གི་གཤམ་ཐིག་འདི་ ༡༠༠% A གི་དོན་ལུ་ སྐར་མ་ ༠ ལས་ ༢ དང་ ༩༩% B གི་དོན་ལུ་ སྐར་མ་ ༢ ལས་ ༧.༡ དེ་ལས་ ༩༩% B གི་དོན་ལུ་ སྐར་མ་ ༧.༡ ལས་ ༨ ཚུན་ཨིན། . བཞུར་ཚད་འདི་ ༠.༤ml/min ཨིནམ་དང་ ཀ་ཆེན་ཁང་མིག་འདི་ ༥༠°C ལུ་དྲོད་བཏང་ཡོདཔ་ཨིན། བཀག་འཛིན་དུས་ཚོད་ (RT) དང་བསྒྱུར་བཅོས་ (RT = སྐར་མ་ ༠.༨༨༢ བསྒྱུར་བཅོས་ ༡ = ༡༣༧→༩༤.༡ བསྒྱུར་བཅོས་ ༢ = ༡༣༧→བསྒྱུར་བཅོས་→༣༧༢) གཞི་བཙུགས་འབད་ནིའི་དོན་ལུ་ MNA གི་རྫས་ཁམས་ཚད་གཞི་ངོ་མ་ (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ལག་ལེན་འཐབ། འགྱུར་བ་གསུམ་ཆ་ར་ བཀག་བཞག་དུས་ཚོད་ངེས་བདེན་ནང་འབྱུང་པའི་སྐབས་ འགྱུར་བ་༡ འདི་ དམིགས་བསལ་གྱི་ངེས་གཏན་བཟོ་ནི་ལུ་ འབོར་ཚད་ཀྱི་དོན་ལུ་ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན། ཚད་གཞི་གུག་གུགཔ་ MNA (Toronto Research Chemical Company) འདི་ ཚད་གཞི་ ༠.༡ དང་ ༡.༠ དེ་ལས་ ༡༠ དང་ ༡༠༠ ng/ml དེ་ལས་ ༡.༠ དང་ ༡༠μg/ml གི་ཚད་གཞི་ཐོབ་ནིའི་དོན་ལུ་ རིམ་ཐོན་གྱི་ ཆུ་བཏང་ཐངས་དྲུག་གིས་ བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། བརྟག་དཔྱད་ཚད་གཞི་འདི་ ༡ ng/ml དང་ རིམ་འགྲོས་ལན་འདེབས་འདི་ ༡༠ ng/ml དང་ ༡༠μg/ml གི་བར་ན་ཡོདཔ་ཨིན། དཔེ་ཚད་དང་ཚད་གཞི་མའི་ཀོ་ལི་ཊར་གཉིས་ཀྱི་སྨན་ཁབ་རེ་རེ་གིས་ LC/MS དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་དོ་ཡོདཔ་ད་ དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་སྟེགས་བུ་འདི་ བརྟན་ཏོག་ཏོ་བཟོ་ཐབས་ལུ་ སྨན་ཁབ་བརྒྱད་རེ་ནང་ སྤུས་ཚད་ཚད་འཛིན་དཔེ་ཚད་སླ་བསྲེ་རྐྱབ་སྟེ་ གཡོག་བཀོལ་དོ་ཡོདཔ་ཨིན། སྨན་བཅོས་འབད་མི་ཁམས་ཕྲན་དཔེ་ཚད་ཚུ་གི་ MNA ལན་གསལ་ཚུ་ བརྟག་དཔྱད་ཀྱི་རིམ་འགྲོས་ཁྱབ་ཚད་ནང་ལུ་ཡོདཔ་ཨིན། གནས་སྡུད་དབྱེ་དཔྱད་འདི་ MassHunter འབོར་ཚད་དབྱེ་དཔྱད་མཉེན་ཆས་ (v9.0, Agilent) ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འབད་ཡོདཔ་ཨིན།
མི་རབས་གཉིས་པའི་αFR-CAR བཟོ་བཀོད་འདི་ Song et al ལས་བཏོན་ཡོདཔ་ཨིན། (༥༩)། མདོར་བསྡུ་བ་ཅིན་ བཟོ་བཀོད་འདི་ནང་ལུ་ གཤམ་གསལ་གྱི་ནང་དོན་ཚུ་ཡོདཔ་ཨིན། CAR གོ་རིམ་ཆ་ཚང་འདི་ GenScript གི་ཐོག་ལས་ མཉམ་སྦྱོར་འབད་དེ་ འདི་གི་ཤུལ་ལས་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་བཅོས་འབད་དེ་ རིགས་མཚུངས་བཟོ་ཡོདཔ་ཨིན།
Lentivirus འདི་ HEK293T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ བརྗེ་སོར་འབད་དེ་ བཟོཝ་ཨིན། [ཨ་མི་རི་ཀའི་རིགས་ལམ་སྲོལ་བསྡུ་སྒྲིག་ (ATCC); འདི་ཡང་ དྲུལ་བེ་ཀོ་གི་བཟོ་བཅོས་འབད་མི་ ཨི་གཱལ་བརྒྱུད་ལམ་ནང་ལུ་ བརྒྱ་ཆ་༡༠དེ་ཅིག་ མངལ་ནང་ལུ་ཡོད་པའི་ ནོར་གྱི་ཁྲག་རྒྱུན་དང་ བརྒྱ་ཆ་༡དེ་ཅིག་ པེན་ཨིསི་ཀྲེཔ་ཡོདཔ་སྦེ་ཨིནམ་དང་ འདི་ནང་ལུ་ CAR-GFP vector དང་ ཐུམ་སྒྲིལ་གྱི་པཱལསི་མིགྲ་ཚུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཕྲ་རབས་ནད་འབུཔ་ཡོད་པའི་ ཆུ་འདི་ འཕོ་སོར་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ ཆུ་ཚོད་༤༨དང་༧༢གི་ཤུལ་ལས་ བསྡུ་གསོག་འབད་དེ་ ཚགས་ཞིནམ་ལས་ ultracentrifugation གི་ཐོག་ལས་ བསྡུ་སྒྲིག་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། ཕྲ་རབས་ནད་འབུཔ་གི་ཆུ་འདི་ -༨༠°C ལུ་ བསྒྱུར་བཅོས་མ་འབད་ཚུན་ཚོད་ གསོག་འཇོག་འབད་དགོ།
PBMC འདི་ Ficoll gradient density centrifugation གི་ཐོག་ལས་ གསོ་བའི་ཞལ་འདེབས་བྱིན་མི་ leukocyte དབྱེ་བ་ཕྱེ་ནི་གི་ཐོན་སྐྱེད་ ༼STEMCELL Technologies༽ ལས་ དབྱེ་བ་ཕྱེ་ཚུགསཔ་ཨིན། CD8+ ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ PBMC ལས་སོ་སོ་སྦེ་བཏོན་ནིའི་དོན་ལུ་ CD8 microbeads (Miltenyi) གི་གདམ་ཁ་ལེགས་ཤོམ་ལག་ལེན་འཐབ། ཊཱན་ཨེགསི་ཊི་ (མིལ་ཊེ་ནི་) དང་ ཊེགསི་མེཀ་སི་བརྒྱུད་ལམ་ནང་ ཊི་ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ སྐུལ་མ་འབད། [Miltenyi; 3% ཚ་དྲོད་མེད་པའི་མི་གི་ཁྲག་ཤེད་དང་ 1% PenStrep དེ་ལས་ IL-2 (300 U/ml)] ཚུ་ ལྷན་ཐབས་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། སེམས་ཤུགས་བསྐྱེད་པའི་ཤུལ་ལས་ ཆུ་ཚོད་༢༤ གི་རིང་ལུ་ T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ lentivirus དང་ཅིག་ཁར་ བརྗེ་སོར་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter)), Singlet, GFP+ གུ་ལུ་ བསྒྱུར་བཅོས་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ ཉིནམ་༡ ལས་༣ གྱི་བར་ན་ ཁམས་ཕྲན་གྱི་ GFP བརྡ་སྟོན་འདི་ དབྱེ་ཞིབ་འབད་དེ་ བསྒྱུར་བཅོས་ཀྱི་ ཇོན་ཐངས་འདི་ ཉུང་ཤོས་རང་ བརྒྱ་ཆ་༣༠ དེ་ཅིག་ བཏོན་ཚུགསཔ་ཨིན།
CAR-T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ གཤམ་གསལ་གྱི་གནས་སྟངས་ཚུ་གི་འོག་ལུ་ Immunocult ནང་ལུ་ ཆུ་ཚོད་༢༤གི་རིང་ལུ་ གསོ་སྐྱོང་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། སྔོན་འགྲོའི་སྨན་བཅོས་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ CAR-T ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ PBS གིས་བཀྲུ་ཞིནམ་ལས་ SK-OV-3 ཁམས་ཕྲན་ ༢༠༠༠༠ དང་མཉམ་སྡེབ་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། [ATCC; McCoy 5A བརྒྱུད་ལམ་ནང་ལུ་ (Sigma-Aldrich) བརྒྱ་ཆ་༡༠ FBS དང་ བརྒྱ་ཆ་༡ PenStrep གིས་ ༡༠ ལུ་ ལྷན་ཐབས་འབད་ཡོདཔ་ཨིན། SK-OV-3 ཁམས་ཕྲན་དང་ SK-OV-3 ཁམས་ཕྲན་ཚུ་ ཌི་ཇི་ཊལ་ས་པོ་ནིན་ (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) དང་ཅིག་ཁར་ lysed འབད་མི་ཚུ་ གོ་རིམ་བཞིན་དུ་ ངན་པ་དང་ ངེས་གཏན་ཚད་འཛིན་སྦེ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཡོདཔ་ཨིན། ཆུ་ཚོད་༢༤ གི་རིང་ མཉམ་རུབ་ཐོག་ལས་ འཛུགས་སྐྱོང་འབད་བའི་ཤུལ་ལས་ ཆུ་ནང་ལས་ ཆུ་བཏོན་ཏེ་ བཟོ་བསྐྲུན་འབད་མི་ཚུ་གི་ བཀོད་རྒྱ་དང་འཁྲིལ་ཏེ་ ལེག་ཊེཊ་ཌི་ཧའི་ཌོ་ཇེ་ནེསི་ (LDH) འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན་པས། LDH གི་ཆུ་འདི་ LDH གི་བཱ་ཕར་ནང་ལུ་ ༡:༥༠ གི་ཐོག་ལས་ བླུགས་ཡོདཔ་ཨིན། བསད་པའི་བརྒྱ་ཆ་འདི་ གཤམ་གསལ་གྱི་ཐབས་གཞི་ལག་ལེན་འཐབ་སྟེ་ འཇལ་ཡོདཔ་ཨིན། བསད་པའི་བརྒྱ་ཆ་ = ནོར་བཅོས་ཀྱི་བརྒྱ་ཆ་ / བསད་པའི་ཚད་གཞི་མཐོ་ཤོས་ x བརྒྱ་ཆ་༡༠༠ དེ་ནང་ ནོར་བཅོས་ཀྱི་བརྒྱ་ཆ་ = མཉམ་འབྲེལ་ལམ་སྲོལ་-ཊི་ཁམས་ཕྲན་རྐྱངམ་ཅིག་ དེ་ལས་ བསད་པའི་ཚད་གཞི་མཐོ་ཤོས་ = ངེས་གཏན་ཚད་འཛིན་-ལོག་པའི་ཚད་འཛིན།
ཚིག་ཡིག་ཡང་ན་རྒྱུ་ཆ་དང་ཐབས་ལམ་ཚུ་ནང་གསལ་བཀོད་འབད་ཡོད་དོ་བཟུམ་སྦེ་ རྩིས་དཔྱད་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ གཱརཕ་པེཌི་པིརིསིམ་༨ དང་ མའི་ཀོརོ་སོཕཊི་ཨེགསི་སེལ་ ཡང་ན་ ཨར་ཝི་༣.༦.༠ ལག་ལེན་འཐབ། གལ་སྲིད་ ནདཔ་གཅིག་ལས་ དཔེ་ཚད་ལེ་ཤ་ཅིག་བསྡུ་ལེན་འབད་བ་ཅིན་ ༼དཔེར་ན་ མཆིནམ་དང་ རྨེན་བུ་བཟུམ་༽ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཆ་གཅིག་འབད་མི་ t བརྟག་དཔྱད་ལག་ལེན་འཐབ་ནི་དང་ ཡང་ན་ ནདཔ་འདི་ འོས་འབབ་དང་བསྟུན་ རིམ་འགྲོས་དང་ ཡང་ན་ སྤྱིར་བཏང་གི་དཔེ་ཚད་ནང་ གང་བྱུང་གྱི་གནོད་པ་ཅིག་སྦེ་ བཙུགསཔ་ཨིན། བཅུད་འགྱུར་རིག་པའི་དབྱེ་དཔྱད་ཀྱི་དོན་ལུ་ ཁག་ཆེ་བའི་བརྟག་དཔྱད་འདི་ ཚར་གསུམ་སྦེ་འབདཝ་ཨིན།
རྩོམ་ཡིག་འདི་གི་དོན་ལུ་ ལྷན་ཐབས་ཀྱི་རྒྱུ་ཆ་ཚུ་གི་དོན་ལུ་ ཁ་བྱང་འདི་གཟིགས་གནང་།
འདི་ཡང་ མཐའ་མཇུག་ལག་ལེན་འདི་ ཚོང་འབྲེལ་གྱི་ཁེ་ཕན་གྱི་དོན་ལུ་མེན་པར་ ལཱ་ངོ་མ་འདི་ བདེན་པ་ཨིན་པ་ཅིན་ བརྒྱུད་ལམ་གང་རུང་ཅིག་ནང་ ལག་ལེན་འཐབ་ནི་དང་ བཀྲམ་སྤེལ་འབད་ནི་ དེ་ལས་ བསྐྱར་བཟོ་འབད་ཆོག་པའི་ གསར་གཏོད་སྤྱིར་བཏང་གི་ ཆོག་ཐམ་གྱི་ གནས་ཚིག་ཚུ་གི་འོག་ལུ་ བཀྲམ་སྤེལ་འབད་ཡོད་པའི་ ཁ་ཕྱེ་སྟེ་ཡོད་པའི་ རྩོམ་བྲིས་ཅིག་ཨིན། རྒྱབ་རྟེན།
དྲན་འཛིན་: ཁྱོད་ཀྱིས་ ཤོག་ལེབ་ལུ་ གྲོས་འཆར་བཀོད་མི་ མི་ངོམ་འདི་གིས་ ཁྱོད་ཀྱིས་ གློག་འཕྲིན་འདི་ བལྟ་དགོཔ་སྦེ་ ཤེས་ཚུགས་ནིའི་དོན་ལུ་ ང་བཅས་ཀྱིས་ ཁྱོད་རའི་གློག་འཕྲིན་ཁ་བྱང་འདི་ ཨིས་པམ་མེན་ཟེར་ ཤེས་ཚུགསཔ་སྦེ་ དྲིཝ་ཨིན། ང་བཅས་ཀྱིས་ གློག་འཕྲིན་ཁ་བྱང་གང་རུང་ཅིག་ བཟུང་མི་བཏུབ།
དྲི་བ་འདི་ ཁྱོད་ལྟ་བཤལཔ་ཨིན་ན་མེན་ན་ བརྟག་ཞིབ་འབད་ནི་དང་ རང་བཞིན་གྱིས་ ཨིས་པམ་གཏང་ནི་བཀག་ཐབས་ལུ་ ལག་ལེན་འཐབ་ཨིན།
མ་རི་ས་ཀེ་ཀིལ་གཱོར་ (Marisa K. Kilgour) དང་ ས་ར་མེག་ཕར་སོན་ (Sarah MacPherson) ལཱུ་རེན་ཇི་ཟ་ཁ་རི་ཡས་ (ལཱུ་རེན་ཇི་ཟ་ཁ་རི་ཡས་) ཨ་བི་གཱལ་ཨེ་ལི་ཨེ་རིསི་ཇི་ཝཊ་སོན་ (ཨེཆ་ཝཊ་སོན་) ཇོན་ཨིསི་ཊེག་ཌི་ནི་རཱ་སེལ་ཕི་ (ཇོན་ཨིསི་ཊེག་) བེརཌ་ཨེཆ་ཇོན་རར་ནེལ་སཱོན་ (བེརཌ་ཨེཆ་ནེལ་སཱོན) རལ་ཕ་ཇེ་ཌི་བི་བེལ་ (རལ་ཕ་ཇེ་ཌི་བི་བེལ་) (རཱ་སེལ་ཇི་ཇོན་) ཕི་ནིས་ཊི་ཧེ་མིལ་ཊོན་ (ཕི་ནིས་ཊི་
ཨེམ་ཨེན་ཨེ་གིས་ ཀྲི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ནད་ཐུབ་མར་ཕབ་འབད་ནི་ལུ་ ཕན་གྲོགས་འབདཝ་མ་ཚད་ མི་གི་ཀེན་སར་གྱི་སྨན་བཅོས་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ནད་ཐུབ་སྨན་བཅོས་ཀྱི་དམིགས་གཏད་ཅིག་སྦེ་ངོ་བཏོནམ་ཨིན།
མ་རི་ས་ཀེ་ཀིལ་གཱོར་ (Marisa K. Kilgour) དང་ ས་ར་མེག་ཕར་སོན་ (Sarah MacPherson) ལཱུ་རེན་ཇི་ཟ་ཁ་རི་ཡས་ (ལཱུ་རེན་ཇི་ཟ་ཁ་རི་ཡས་) ཨ་བི་གཱལ་ཨེ་ལི་ཨེ་རིསི་ཇི་ཝཊ་སོན་ (ཨེཆ་ཝཊ་སོན་) ཇོན་ཨིསི་ཊེག་ཌི་ནི་རཱ་སེལ་ཕི་ (ཇོན་ཨིསི་ཊེག་) བེརཌ་ཨེཆ་ཇོན་རར་ནེལ་སཱོན་ (བེརཌ་ཨེཆ་ནེལ་སཱོན) རལ་ཕ་ཇེ་ཌི་བི་བེལ་ (རལ་ཕ་ཇེ་ཌི་བི་བེལ་) (རཱ་སེལ་ཇི་ཇོན་) ཕི་ནིས་ཊི་ཧེ་མིལ་ཊོན་ (ཕི་ནིས་ཊི་
ཨེམ་ཨེན་ཨེ་གིས་ ཀྲི་ཁམས་ཕྲན་གྱི་ནད་ཐུབ་མར་ཕབ་འབད་ནི་ལུ་ ཕན་གྲོགས་འབདཝ་མ་ཚད་ མི་གི་ཀེན་སར་གྱི་སྨན་བཅོས་འབད་ནི་གི་དོན་ལས་ ནད་ཐུབ་སྨན་བཅོས་ཀྱི་དམིགས་གཏད་ཅིག་སྦེ་ངོ་བཏོནམ་ཨིན།
©2021 ཨ་མི་རི་ཀའི་ཚན་རིག་གོང་འཕེལ་ཚོགས་པ། ཐོབ་ཐང་ཆ་ཚང་ཉར་ཡོད། AAAS འདི་ HINARI དང་ AGORA OARE CHORUS CLOCKSS ཀོརསི་རིཕ་ དེ་ལས་ ཀའུན་ཊར་ཚུ་གི་མཉམ་འབྲེལ་པ་ཅིག་ཨིན། མཚོན་རིག་གོང་འཕེལ་ ISSN 2375-2548